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4.3 使用 Seurat 进行数据预处理

创建 Seurat 对象和导入数据

首先执行以下命令，创建 Seurat 对象。这将完成数据的导入。

pbmc.data <- Read10X(data.dir = "./filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
pbmc <- CreateSeuratObject(
  counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200
)
pbmc

质量控制 (QC) 和过滤

在 scRNA-seq 中，使用小提琴图进行质量控制，以检查是否存在异常的细胞。

低质量的细胞（如死细胞）通常会表现出极低的基因表达量或存在线粒体来源的污染。此外，如果在计数基因数时细胞发生双胞现象（即不是单细胞），则会导致异常的基因数计数。

# 使用以MT-开头的所有基因作为线粒体基因集合
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

运行上述代码后，RStudio 的右下角应会出现如下图所示的小提琴图。

通过查看小提琴图的膨胀部分，可以确定细胞群体的合理基因计数。以下是此次样本的质量控制参考值：

  • 基于 nFeature_RNA，过滤掉唯一特征数大于 2,500 或小于 200 的细胞。
  • 基于 percent.mt，过滤掉线粒体基因数超过 5% 的细胞。

image.png

为了查看各变量之间的相关性，可以使用散点图。请执行以下代码：

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2

运行上述代码后，你会看到两个散点图：

  • percent.mt 与 nCount_RNA 之间没有显著的相关性（相关系数为 -0.13）。
  • nFeature_RNA 与 nCount_RNA 之间存在显著的相关性（相关系数为 0.95）。

重新筛选符合 QC 标准的细胞

在进行质量控制后，我们需要将筛选出的细胞重新存储到 pbmc 对象中：

pbmc <- subset(
  pbmc,
  subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5
)

数据的规范化和缩放

在通过 QC 从数据集中移除不需要的细胞后，需要对数据进行规范化处理。

默认情况下，Seurat 采用全局缩放规范化方法“LogNormalize”。这种方法通过对每个细胞的特征表达量进行规范化，除以总表达量，然后乘以缩放因子（默认是 10,000），并对结果进行对数转换。

# 数据规范化
pbmc <- NormalizeData(
  pbmc,
  normalization.method = "LogNormalize",
  scale.factor = 10000
)

# 将规范化后的数据重新存储到pbmc对象中
pbmc <- NormalizeData(pbmc)

到此为止，scRNA-seq 数据的预处理已完成。接下来的步骤将是对规范化数据的可视化方法进行解释。