6.1 如何使用 Cell Ranger 统计 scRNA seq 数据中的基因表达水平

什么是 Cell Ranger？¶

Cell Ranger 是由 10x Genomics 公司开发的软件包，用于单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 数据的预处理和分析。它专门用于分析使用 10x Genomics 的 Chromium 系统进行单细胞 RNA-seq 实验所得的数据。下图展示了在测序之后的数据处理部分由 Cell Ranger 负责。

Cell Ranger 的输出结果可以用于后续的分析，如数据降维（t-SNE 或 PCA）、聚类分析和差异表达分析等。

Cell Ranger 的主要管道¶

Cell Ranger 包含以下主要管道：

cellranger mkfastq: 将原始 BCL 文件（直接从测序仪输出的文件格式）转换为 FASTQ 格式（生物信息分析中常用的格式）。
cellranger count: 以 FASTQ 文件为输入，进行读段比对、过滤和 UMI 计数（表示每个细胞/基因的表达量），生成细胞基因表达矩阵。
cellranger aggr: 结合多个 cellranger count 的结果，使这些数据在同一分析空间中可以比较。
cellranger reanalyze: 基于已获得的 cellranger count 或 cellranger aggr 结果，使用新参数进行聚类和降维等分析。
cellranger multi: 同时处理不同类型的单细胞数据（如 RNA-seq 和 ATAC-seq），进行整合分析。

通过组合这些管道，可以管理从原始测序数据到获取分析结果的一系列过程。

主要管道介绍¶

接下来，我们将参考 10X Genomics 提供的实操教程，介绍主要使用的 cellranger mkfastq、cellranger count 和 cellranger aggr 管道的具体实现方法。

环境构建¶

首先，需要构建运行 Cell Ranger 的环境。

重要提示：Cell Ranger 只能在 Linux 操作系统上运行。这意味着我们通常使用的 Windows 或 Mac 系统不能直接运行它。因此，Windows 用户需要安装 Ubuntu，Mac 用户则需要使用 Docker 来运行（当然，Windows 用户也可以使用 Docker）。

这次，我们将使用 Docker image 在 Mac 环境中运行 Cell Ranger。以下步骤假设 Docker Desktop 已经安装。Windows 用户可以参考本文中的“Ubuntu 安装”部分来安装 Ubuntu。对于不需要准备 Docker 环境的 Windows 用户，可以直接跳到“运行 cellranger mkfastq”部分。

安装 Cell Ranger 的 Docker image¶

docker pull litd/docker-cellranger

在 Docker UI 中按下终端按钮以启动终端。

如果无法从 UI 启动，可以使用 `docker run -it` 命令来启动。可以从 UI 复制容器 ID。¶

docker run -it [ee0a61935c4f49f03a18ee3a9c1f8c17e4437dda43ca1b5e9d07577565632 (容器ID示例)]

启动后，请创建 yard 目录。基本操作将在这个 yard 目录中进行。

mkdir yard

运行 cellranger mkfastq¶

如果公共数据库中已经有 FASTQ 文件，则无需执行此步骤。如果没有，需要在分析前使用 mkfastq 创建 FASTQ 文件。

mkfastq 通过两个步骤运行：

去重多重标签：去重多重标签是将一个测序运行中包含的多个样本分离的过程。由于每个样本使用唯一的条形码，mkfastq 读取这些条形码并准确识别每个样本的读段。
生成 Fastq 文件：去重多重标签后，mkfastq 使用这些信息生成 Fastq 文件。Fastq 文件包含测序读段及其质量评分，是后续测序分析（如读段比对、基因计数等）的输入。

以下是运行 mkfastq 的实际步骤：

创建 run_cellranger_mkfastq 目录并进入：

mkdir /yard/run_cellranger_mkfastq
cd /yard/run_cellranger_mkfastq

下载并解压示例文件：

wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/cellranger-tiny-bcl-1.2.0.tar.gz
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv
tar -zxvf cellranger-tiny-bcl-1.2.0.tar.gz

解压成功后，将看到以下文件：

cellranger-tiny-bcl-1.2.0/
cellranger-tiny-bcl-1.2.0/Data/
cellranger-tiny-bcl-1.2.0/Data/Intensities/
cellranger-tiny-bcl-1.2.0/Data/Intensities/BaseCalls/
cellranger-tiny-bcl-1.2.0/Data/Intensities/BaseCalls/L001/
cellranger-tiny-bcl-1.2.0/Data/Intensities/BaseCalls/L001/C25.1/
cellranger-tiny-bcl-1.2.0/Data/Intensities/BaseCalls/L001/C25.1/s_1_1101.bcl.gz
...

运行 mkfastq：

cellranger mkfastq --id=tutorial_walk_through.\ \$
  --run=/yard/run_cellranger_mkfastq/cellranger-tiny-bcl-1.2.0.\ \$
  --csv=/yard/run_cellranger_mkfastq/cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv

成功运行后，将看到以下输出：

sh-4.4# cellranger mkfastq --id=tutorial_walk_through.\ \$
>   --run=/yard/run_cellranger_mkfastq/cellranger-tiny-bcl-1.2.0.\ \$
>   --csv=/yard/run_cellranger_mkfastq/cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv
/opt/cellranger-7.1.0/bin
cellranger mkfastq (cellranger-7.1.0)
Copyright (c) 2021 10x Genomics, Inc.  All rights reserved.
-------------------------------------------------------------------------------

Martian Runtime - v4.0.10
2023-06-11 11:57:52 [runtime] Reattaching in local mode.
Serving UI at http://4b9cb242f622:39525?auth=TKb2F_7AUK6OGai2jN2JBiMtSEysYDXQV3OIbXZURdo

Outputs:
- FASTQ output folder:   /yard/run_cellranger_mkfastq/tutorial_walk_through/outs/fastq_path
- Interop output folder: /yard/run_cellranger_mkfastq/tutorial_walk_through/outs/interop_path
- Input samplesheet:     /yard/run_cellranger_mkfastq/tutorial_walk_through/outs/input_samplesheet.csv

Waiting 6 seconds for UI to do final refresh.
Pipestance completed successfully!

2023-06-11 11:57:58 Shutting down.
Saving pipestance info to "tutorial_walk_through/tutorial_walk_through.mri.tgz"

生成的 FASTQ 文件位于 /yard/run_cellranger_mkfastq/tutorial_walk_through/outs/fastq_path/H35KCBCXY/test_sample 目录中。可以使用以下命令查看：

cd tutorial_walk_through/outs/fastq_path/H35KCBCXY/test_sample
ls

您将看到类似如下的 FASTQ 文件：

sh-4.4# ls
test_sample_S1_L001_I1_001.fastq.gz  test_sample_S1_L001_R1_001.fastq.gz  test_sample_S1_L001_R2_001.fastq.gz

运行 cellranger count¶

为了从 FASTQ 文件中获得基因表达计数，运行 cellranger count。这是 Cell Ranger 管道的主要步骤，进行读段比对、过滤、条形码计数和 UMI（唯一分子标识符）计数等一系列分析。

创建 run_cellranger_count 目录并进入：

mkdir /yard/run_cellranger_count
cd /yard/run_cellranger_count

下载并解压示例文件：

wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_fastqs.tar
tar -xvf pbmc_1k_v3_fastqs.tar

下载参考基因组：

wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
tar -zxvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

运行 cellranger count：

cellranger count --id=run_count_1kpbmcs.\ \$
   --fastqs=/yard/run_cellranger_count/pbmc_1k_v3_fastqs.\ \$
   --sample=pbmc_1k_v3.\ \$
   --transcriptome=/yard/run_cellranger_count/refdata-gex-GRCh38-2020-A

参数说明：

--id=run_count_1kpbmcs：指定输出目录的名称。
--fastqs=/yard/run_cellranger_count/pbmc_1k_v3_fastqs：指定输入 FASTQ 文件所在目录。
--sample=pbmc_1k_v3：指定样本名称，FASTQ 文件名中应包含此样本名。
--transcriptome=/yard/run_cellranger_count/refdata-gex-GRCh38-2020-A：指定使用的转录组参考数据的路径。

完成后，结果将存储在 /yard/run_cellranger_count/tutorial_count/outs 目录中。可以使用以下命令查看输出文件：

cd /yard/run_cellranger_count/tutorial_count/outs
ls

输出文件可能包括：

analysis                    filtered_feature_bc_matrix.h5   metrics_summary.csv
cloupe.cloupe               filtered_feature_bc_matrix      molecule_info.h5
filtered_feature_bc_matrix  possorted_genome_bam.bam        web_summary.html

运行 cellranger aggr¶

cellranger aggr 是用于组合多个 cellranger count 输出（即来自多个样本或实验的单细胞 RNA-seq 数据）的管道。该管道规范化每个数据集并将它们合并为一个表达矩阵，使得可以跨多个样本或条件进行分析。

创建 run_cellranger_aggr 目录并进入：

mkdir run_cellranger_aggr
cd run_cellranger_aggr

下载示例文件：

wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_1k_v3/pbmc_1k_v3_molecule_info.h5
wget https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/3.0.0/pbmc_10k_v3/pbmc_10k\_v3_molecule_info.h5

创建一个包含文件路径的 CSV 文件：

使用 vi 创建 pbmc_aggr.csv：

vi pbmc_aggr.csv

添加以下内容：

sample_id,molecule_h5
1k_pbmcs,/path/to/run_cellranger_aggr/pbmc_1k_v3_molecule_info.h5
10k_pbmcs,/path/to/run_cellranger_aggr/pbmc_10k_v3_molecule_info.h5

运行 cellranger aggr：

cellranger aggr --id=1k_10k_pbmc_aggr --csv=pbmc_aggr.csv

输入的每个样本的数据将被整合为一个计数矩阵，输出文件存储在 /yard/run_cellranger_aggr/tutorial_aggr/outs 目录中。可以使用以下命令查看输出文件：

cd /yard/run_cellranger_aggr/tutorial_aggr/outs
ls