Neutrophil profiling illuminates anti tumor antigen presenting potency

摘要¶

中性粒细胞是抵御病原体最丰富和最有效的防御者之一，在不同癌症类型中表现出相反的功能。然而，由于它们的半衰期较短，探索中性粒细胞在癌症中如何采取特定命运仍然具有挑战性。在这里，我们生成并整合了来自 17 种癌症类型（225 个样本，来自 143 位患者）的单细胞中性粒细胞转录组。中性粒细胞表现出非凡的复杂性，具有 10 种不同状态，包括炎症、血管生成和抗原呈递。值得注意的是，抗原呈递程序与大多数癌症中的良好生存率相关，并且可以通过亮氨酸代谢及其后的组蛋白 H3K27ac 修改来激发。这些中性粒细胞进一步能够激发（新）抗原特异性和抗原非依赖性 T 细胞反应。中性粒细胞的输送或亮氨酸饮食可以微调免疫平衡，从而在各种小鼠癌症模型中增强抗 PD-1 疗法的效果。总之，这些数据不仅表明了中性粒细胞在癌症中的分化，还提示了如抗原呈递中性粒细胞输送等治疗机会。

引言¶

中性粒细胞被认为是抵抗病原体速度最快的细胞。它们可以感知多种癌症信号，例如炎症和伤口，从而启动趋化模块，向肿瘤微环境 (TME) 移动。然而，人类中性粒细胞寿命通常太短（半衰期：6-8 小时），无法进行详细分析，这使得大多数单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 方法无法实现这些细胞的高通量分析。由于中性粒细胞的 mRNA 含量较低（中性粒细胞：每百万细胞 0.33 毫克；巨噬细胞和单核细胞：每百万细胞 2.55 毫克），尽管这些细胞普遍分布于全身器官和肿瘤中，我们对人类中性粒细胞转录组多样性和时空异质性的理解仍然处于初步阶段。

在癌症免疫学领域，中性粒细胞到底是抑制性还是保护性，这个悖论仍然没有解决。长期以来，人们一直认为肿瘤相关中性粒细胞具有免疫抑制性，会恶化患者预后。然而，最近的研究表明，这些细胞可以通过释放活性弹性蛋白酶、一氧化氮合酶或活性氧 (ROS) 来杀死癌细胞。此外，中性粒细胞还具有抗肿瘤免疫表型，可促进自体 T 细胞反应或干扰素相关免疫刺激效应。这些看似矛盾的数据提出了关键但尚未充分理解的问题，即细胞群体的组成以及哪些亚群驱动促肿瘤或抗肿瘤效应。系统地解码肿瘤浸润性中性粒细胞的细胞多样性将有助于识别它们不同的基因表达模式及其所处的生态位框架。

在这种情况下，单细胞分析非常适合表征中性粒细胞状态，并有机会创建基于数据的粒细胞发育图谱。为了应对这一挑战，我们设计了一种中性粒细胞分析策略，并从来自 17 种癌症类型（包括选定癌症的配对转移灶）的 143 名患者收集的 225 个样本中产生了单个中性粒细胞转录组。我们发现中性粒细胞表现出复杂多样的转录组谱，具有 10 种不同的细胞状态，其中三种可能在多种癌症类型中占主导地位，包括炎症、血管生成和抗原呈递。特别是，呈递抗原的中性粒细胞表现出独特的免疫表型和代谢特征，可以诱导 T 细胞新抗原反应性。我们的研究不仅产生了癌症中性粒细胞转录组，还揭示了潜在的治疗机会，例如呈递抗原的中性粒细胞递送。

结果¶

嗜中性粒细胞优先浸润到某些癌症类型¶

中性粒细胞浸润实体瘤的程度差异很大 [15]，但目前对于确切的癌症类型和浸润水平尚无共识。为了探索浸润模式并选择合适的癌症类型，我们测试了 8 种常见的免疫量化算法，并分析了包含来自 31 种实体癌的 8766 个样本的癌症基因组图谱 (TCGA)（STAR 方法）。我们基于三种算法开发了一致性中性粒细胞浸润评分 [16-18]，该评分揭示了强烈的组织选择性中性粒细胞浸润模式，可以聚类成 3 个亚型（29.6% 高、30.0% 异质和 40.4% 低；图 1A 和 S1A）。例如，中性粒细胞在肺癌和肾癌中显示高浸润，在胃肠道癌中显示中等浸润，这与另一个泛癌数据集 - 临床蛋白质组肿瘤分析联盟 (CPTAC) 的结果一致 [19]（图 S1B 和 S1C）。通过比较免疫亚型中的中性粒细胞水平 [20, 21]，我们观察到炎症或纤维化抑制性肿瘤微环境 (TME) 中优先浸润中性粒细胞 (图 1B)，这与先前报道的中性粒细胞浸润模式和功能一致 [15]。总之，这些数据强调了中性粒细胞浸润的多样性，取决于组织和癌症类型，为我们后续的中性粒细胞取样策略提供了基础。

遵循我们的初步发现，我们设计了一种标准化取样策略，重点关注具有高或中等中性粒细胞浸润的癌症类型（样本统计数据，图 S1D），确保在可用时包含匹配的血液、邻近正常组织和转移瘤样本。考虑到短半衰期和数据质量，我们进一步设计了中性粒细胞分选方案 (图 S1E) 和计算机模拟策略 (STAR 方法)。我们成功对通过质量控制的 64 名患者的 103 个样本进行测序（表 S1），包括原发性和转移性样本以及匹配的正常组织和血液 (STAR 方法)。我们进一步将标准化流程应用于已发布的数据集，最终生成来自 17 种癌症类型的 143 名患者的 225 个样本的中性粒细胞图谱，其中 12 种癌症类型数据 (70.59%) 是新生成或内部的 (图 1C)。在对数据批次进行协调、排除低质量细胞和平衡 RNA 丢失之后，最终有 179,908 个单个中性粒细胞通过质量控制，其中 79.29% 的数据是内部的或新近发布的。总之，我们的单细胞谱分析构成了一种潜在的中性粒细胞研究资源（可通过 [invalid URL removed] 访问）。

图 S1. 泛癌症单个中性粒细胞生成、采样策略和程序解码，相关内容见图 1 (A) 来自 TCGA 数据集的泛癌症样本中性粒细胞浸润水平。n = 8,766。癌症类型缩写见表 S1。 (B) 验证来自 CPTAC 数据集的泛癌症样本中性粒细胞浸润水平。n = 1,033。左侧面板表示泛癌症样本中的中性粒细胞浸润。中间面板表示癌症类型。右侧面板表示泛癌症中性粒细胞浸润共识评分的排名。 (C) 两个队列（TCGA 和 CPTAC）中中性粒细胞浸润水平的相关性。x 轴和 y 轴分别表示使用中性粒细胞浸润共识、MCPCounter 中性粒细胞评分、Quantiseq 中性粒细胞评分和 xCell 中性粒细胞评分的 TCGA 和 CPTAC 数据中平均中性粒细胞浸润水平。 (D) 本研究中纳入的肿瘤样本数量与 TCGA 数据之间中性粒细胞浸润水平的相关性。x 轴表示 TCGA 数据中的中性粒细胞浸润中位水平。y 轴表示本研究中纳入的患者。 (E) 流式细胞术排序中的中性粒细胞分选策略。 (F) 来自不同癌症类型的中性粒细胞亚群的 UMAP 图。颜色表示每个中性粒细胞亚群。中性粒细胞低于 500 的癌症类型未显示。 (G) 使用 NMF 的中性粒细胞转录程序（见 STAR 方法）。上方面板表示转移状态和癌症类型。颜色表示每个程序的相关值。右侧文本表示每个程序的富集术语。 (H) 本研究中中性粒细胞亚群与已发表的人类中性粒细胞状态的比较。

跨癌症的转录组特征¶

为了解码转录组特征，我们对中性粒细胞进行聚类，并注意到癌症和组织类型之间存在高度异质性（图 1D 和 S1F）。我们观察到 10 个不同的状态，由 S100A12+、HLA-DR+CD74+、VEGFA+SPP1+、TXNIP+、CXCL8+IL1B+、CXCR2+、IFIT1+ISG15+、MMP9+、NFKBIZ+HIF1A+ 和 ARG1+ 中性粒细胞组成（图 1E 和 1F；表 S2）。例如，HLA-DR+CD74+ 亚群显示主要组织相容性复合体 (MHC)-II 分子高表达并且普遍浸润到各种癌症中。符合中性粒细胞生物学 [15]，我们还鉴定了一些可能代表炎症反应 (CXCL8+IL1B+) 和特定位向迁移 (CXCR2+) 特征的簇 (图 1F)。通过将中性粒细胞转录组解码为转录程序 (STAR 方法)，我们一致地确认了它们特征性的激活模式，例如趋化性或炎症 (图 S1G)。鉴于中性粒细胞单细胞谱分析仅在某些癌症类型中报道，我们计算了先前定义的中性粒细胞状态和亚群 (STAR 方法) 与 5 项独立研究的相关性 [7, 22-25]。我们数据的一些子集与已发布的状态（例如 IFIT1+ISG15+ 和 hNeutro2）显示出强烈的一致性¹

Figure 1. 泛癌单细胞中性粒细胞图谱的构建

(A) 泛癌样本的中性粒细胞一致性浸润水平（TCGA 数据集），显示中性粒细胞浸润水平（左），癌症类型（中），以及排序一致性评分（右）。 (B) 基于免疫亚型的中性粒细胞一致性浸润水平（TCGA 数据集）。 20,21 ***\p < 0.001; 方差分析测试。 (C) 纳入患者和细胞数量（绿色，内部数据；灰色，公共数据）。健康组织对照被排除在外。 (D) UMAP 图（上图）和中性粒细胞比例（下图）。 (E) 中性粒细胞亚群基因表达热图（前 50 个表达）。 (F) 每个中性粒细胞亚群富集的通路。特征来自京都基因组和基因百科全书 (KEGG) 和 Hallmark 数据库。

分子分化和生存相关性¶

为了探索控制中性粒细胞分类的原则，我们计算了树结构 [26]，并观察到不同子集的散布树叶（图 2A）。基于 Ro/e 分析（观察到的细胞数与预期细胞数的比率）（图 2B），HLA-DR+CD74+ 和 VEGFA+SPP1+ 中性粒细胞总体上是癌症富集度最高的亚群（图 2B 和 S2A），但显示出癌症类型偏好。HLADR+CD74+ 中性粒细胞在非小细胞肺癌 (NSCLC)、膀胱癌 (BLCA) 和卵巢癌 (OV) 中富集，而在肾细胞癌 (RCC) 和口腔鳞状细胞癌 (OSCC) 中浸润减少。相比之下，VEGFA+SPP1+ 中性粒细胞在 NSCLC、BLCA 和 OV 中浸润稀疏，但在 RCC 和胃腺癌 (STAD) 中富集。这些数据部分由流式细胞术 (n = 24，见表 S1) 和使用独立的多癌种组织微阵列 (TMA) 队列 (n = 68，见表 S1) 的多重免疫组织化学 (mIHC) 进行验证，该队列包含 8 种癌症类型，包括乳腺浸润性癌 (BRCA)、结肠腺癌 (COAD)、肝内胆管癌 (ICC)、肝细胞癌 (HCC)、STAD、NSCLC、RCC 和胰腺导管癌 (PAAD)（图 2C-2E 和 S2B）。²

为了探索中性粒细胞亚群与患者生存的关系，我们首先基于 TCGA 泛癌数据集分析了中性粒细胞亚群特征。在这些亚群中，VEGFA+SPP1+ 亚群与最差的患者预后相关（图 2F 和 S2C；8 癌种 TMA 队列），而 HLA-DR+ 则与最佳预后相关。我们进一步通过 mIHC 在一个独立的 8 癌种 TMA 队列中证实了 HLA-DR+ 中性粒细胞的预后相关性（图 2G，n = 1,116；HCC，n = 357；COAD，n = 93；NSCLC，n = 90；STAD，n = 85；RCC，n = 150；OV，n = 160；BRCA，n = 129；BLCA，n = 52）。这些数据表明，HLA-DR+ 中性粒细胞可能代表大多数癌症类型中的关键抗肿瘤中性粒细胞亚群。

图 S2. 中性粒细胞亚群的转录组特征，相关内容见图 2 (A) 不同样本类型中中性粒细胞亚群的浸润水平。颜色表示 Ro/e（观察到的细胞数量与预期细胞数量的比值）。较大的 Ro/e 值表示浸润增加。Ro/e 值大于 2 的被规范为 2。 (B) 与图 2D 中显示的在 NSCLC、BRCA 和 HCC（HLA-DR+ 中性粒细胞富集癌症类型）中的相匹配的苏木精染色区域，及在 STAD、RCC 和 ICC（SPP1+ 中性粒细胞富集癌症类型）中的区域。比例尺，30 mm。 (C) 在 8 种癌症 TMA 队列中，使用 mIHC 定量的 COAD、NSCLC、HCC、STAD、RCC、OV、BRCA 和 BLCA 中 SPP1+CD15+ 中性粒细胞的预后价值验证。SPP1+CD15+ 与 CD15+ 中性粒细胞比例的临界值由 R 包 survival 和 survminer 确定，p 值由 log-rank 检验确定。 (D) 中性粒细胞亚群中差异表达的增殖基因和干扰素相关基因的表达谱。 (E) 根据采样时间的中性粒细胞相关特征的昼夜节律。特征来自 GO 和 KEGG 基因集数据库（STAR 方法）。*p < 0.001；Wilcox 检验。 (F) 癌症、胰腺炎、胆囊炎和 COVID-19 样本中中性粒细胞亚群的比例。

接下来，我们比较了不同中性粒细胞亚群的细胞因子谱 (图 2H)。HLA-DR+CD74+ 中性粒细胞显示高水平的 CCL5，可以募集 T 细胞 [27]。IFIT1+ISG15+ 中性粒细胞与 PD-L1 (CD274) 的高表达相关，表明其具有免疫抑制作用。只有 HLA-DR+CD74+ 中性粒细胞显示 MHC II 类分子（例如 HLA-DRA 和 HLA-DRB1）的特定富集（图 2I）。然而，几乎所有中性粒细胞亚群都表达高水平的 MHC I 类分子，这与它们在所有有核细胞上的一致表达相一致 [28]。同时，中性粒细胞亚群的免疫表型特征 [29] 显示出显着的多样性（图 2J），而几乎所有亚群都显示出高衰老特征，支持了肿瘤相关中性粒细胞大多处于成熟状态的概念 [2]。相反，我们还鉴定几乎所有亚群中普遍存在的细胞周期基因表达以及 IFIT1+ISG15+ 中性粒细胞中干扰素相关基因的富集（图 S2D）。鉴于中性粒细胞生物学已知的昼夜节律特征 [30, 31]，我们进一步比较了白天和不同时间采集的表型特征，并观察到白天中性粒细胞的成熟度和趋化性水平更高（图 S2E）。这些数据共同突出了中性粒细胞亚群特有的分子标志。

Figure 2. 嗜中性粒细胞的分子特征和生存相关性

(A) 使用 TooManyCells 工具根据细胞亚群 (左侧) 和癌症类型 (右侧) 构建的嗜中性粒细胞树状结构。26 (B) 不同癌症类型的嗜中性粒细胞 Ro/e (观察到的细胞数与预期细胞数的比率)。左侧点代表泛癌样品的 Ro/e。右侧热图代表每个癌种的 Ro/e。Ro/e > 2 归一化为 2。 (C) 基于 scRNAseq 和流式细胞术的流式细胞术 (第一和第二个 panel) 和 HLA-DR+ (第三个 panel) 或 SPP1+ 嗜中性粒细胞 (第四个 panel) 浸润之间的相关性。y 轴代表流式细胞术估计的比例。细胞门限定位于 CD66b+ 细胞。x 轴代表 scRNA-seq 估计的嗜中性粒细胞亚群 Ro/e。n = 24。 (D) 使用 mIHC 对非小细胞肺癌 (NSCLC)、乳腺癌 (BRCA) 和肝细胞癌 (HCC)（富含 HLA-DR+ 嗜中性粒细胞的癌种）以及直肠癌 (STAD)、肾细胞癌 (RCC) 和胆囊癌 (ICC)（富含 SPP1+ 嗜中性粒细胞的癌种）中的 HLA-DR+ 嗜中性粒细胞进行成像。比例尺，30 毫米。 (E) 基于 scRNA-seq 和 mIHC 的 HLA-DR+ (左侧) 或 SPP1+ 嗜中性粒细胞 (右侧) 浸润之间的相关性。y 轴代表 mIHC 估计的比例。x 轴代表 scRNA-seq 估计的嗜中性粒细胞亚群 Ro/e。n = 68。 (F) 嗜中性粒细胞特征 (TCGA 数据集) 的预后价值，显示风险比值 (左侧) 和嗜中性粒细胞亚群特征的 log (p 值) (右侧)。x 轴的左右两侧都代表正值，因为所有 log (p 值) 都大于零。 (G) 使用 mIHC 对包括 COAD、NSCLC、HCC、STAD、RCC、卵巢癌 (OV)、BRCA 和膀胱癌 (BLCA) 在内的 8 癌组织微阵列 (TMA) 队列中 HLA-DR+CD15+ 嗜中性粒细胞的生存分析。分析了 HLA-DR+CD15+ 细胞与 CD15+ 细胞的比例。p 值由 log-rank 检验确定。有关样本信息，请参见表 S1。

嗜中性粒细胞成熟和代谢状态¶

嗜中性粒细胞长期以来被认为是成熟的终末分化细胞。然而，它们成熟状态多样性的实现机制尚不清楚。为了解决这个问题，我们应用了一种基于向量场的深度学习算法来推断谱系特化和分化的渐进步骤 [32]。我们观察到嗜中性粒细胞状态沿着连续分化，HLA-DR+CD74+ 嗜中性粒细胞具有最长的拟时态值（图 3A 和 S3A）；单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 分析的其他算法，包括 monocle3 [33]、CytoTRACE [34] 和 Slingshot [35] 也重复了这一模式（图 3A 和 S3A）。我们根据肿瘤特异性和拟时态对嗜中性粒细胞进行排序，发现 HLA-DR+CD74+ 嗜中性粒细胞可能停留在终点 (图 3B)。³

Figure 3. HLA-DR+ 中性粒细胞处于终末分化阶段并经过代谢重编程

A. 分化状态评估

利用 scTour、CytoTRACE、monocle3 和 Slingshot 等工具评估中性粒细胞的分化状态 (STAR Methods 部分有详细方法介绍)。 B. 粒细胞亚群与癌症类型和分化状态的关联

上图根据癌症类型 (Ro/e) 和分化状态 (scTour 计算的拟时序) 对中性粒细胞亚群进行排序。下图则显示癌症类型 (Ro/e) 和拟时序之间的相关性。圆点大小代表每个细胞亚群的 Ro/e 值。 C. 中性粒细胞分化标记物表达

从 8 种癌症类型的 24 个肿瘤样本中分离出 HLA-DR+ 和 HLA-DR- 中性粒细胞，并通过流式细胞术检测 CD11b 和 CD16 的平均荧光强度 (MFI)。 (**p < 0.01，***p < 0.001，配对学生 t 检验) (n = 24) D. 多癌种组织微阵列 (TMA) 免疫组化分析

利用 mIHC 技术在多癌种组织微阵列队列中分析 SPP1+CD15+、HLA-DR-CD15+ 和 HLA-DR+CD15+ 中性粒细胞中 CD11bhigh 和 MPOhigh 亚群的比例。 (*p < 0.05，**p < 0.01，学生 t 检验) (n = 68) E. 中性粒细胞相关蛋白表达

利用 mIHC 技术在多癌种组织微阵列队列中检测 HLA-DR+ 和 HLA-DR- 中性粒细胞中 CD11b 和 MPO 的表达强度。尺度条，30 毫米。 F. 中性粒细胞代谢途径活性

利用 scMetabolism.37 工具评估不同中性粒细胞亚群的氨基酸代谢途径活性。

为了验证这一发现，我们首先使用流式细胞术评估了来自 8 种癌症类型 (24 名患者) 的瘤内嗜中性粒细胞成熟标志物 CD11b 和 CD16 (图 3C) 。结果表明，HLA-DR+ 嗜中性粒细胞亚群的 CD11b 和 CD16 表达显着更高。随后，我们使用跨癌种的 mIHC 证实了 HLA-DR+ 嗜中性粒细胞中成熟标志物 (CD11b 和 MPO) [36] 表达增强 (图 3D 和 3E)。此外，转录因子 RFX5 在 HLA-DR+ 亚群中特异性激活，这与 ChIP-seq 和敲低/过表达实验一致（图 S3B-S3E；STAR 方法）。总之，这些数据表明 HLA-DR+ 嗜中性粒细胞可能是终末成熟嗜中性粒细胞亚群之一。

图 S3. 终末分化的 HLA-DR+ 中性粒细胞，其转录因子 RFX5 及代谢特征，相关内容见图 3 (A) 通过 scTour、CytoTRACE、monocle3 和 Slingshot 估算的单个中性粒细胞的伪时间，根据中性粒细胞亚群分类。 (B) 与伪时间相关的转录因子活性显示 RFX5 是 HLA-DR+ 中性粒细胞的潜在转录因子。 (C) 基于我们的 scRNA-seq 数据的 RFX5 活性及其在中性粒细胞中的结合基序的 UMAP 图。大小和颜色表示 RFX5 活性评分的值。 (D) HLA-DRA 和 HLA-DRB1 位点周围的 RFX5 结合强度。数据来源标记在图的右侧面板上。y 轴表示 RFX5 的 DNA 结合 ChIP-seq 强度。 (E) 基于中性粒细胞系 dHL-60 中 RFX5 状态的 HLA-DR、Zombie NIR 和 CD11b 高细胞的流式细胞术强度。n = 3。ns，表示不显著，p < 0.05，*p < 0.01；学生 t 检验。 (F) 基于我们的 scRNA-seq 数据的中性粒细胞亚群的途径活性显示代谢途径在所有途径中排名较高。 (G) 中性粒细胞亚群的碳水化合物代谢途径、外源生物降解与代谢途径、核苷酸代谢途径、能量代谢途径、糖缀合物生物合成与代谢、脂质代谢途径、辅因子和维生素代谢途径以及其他氨基酸代谢活性。点的大小表示与其余细胞相比每个中性粒细胞亚群的 log（倍数变化）。y 轴表示与其余细胞相比每个中性粒细胞亚群的 log（p 值）。颜色表示不同的中性粒细胞亚群。代谢途径活性由 scMetabolism37 确定（参数：imputation = T，metabolism.type = "KEGG"）。代谢途径数据见表 S3。

一个关键问题是通路活性如何在肿瘤嗜中性粒细胞亚群之间变化。为了解决这个问题，我们测量了通路差异，并观察到代谢通路存在强烈多样性（图 S3F），这支持了代谢调节可能维持嗜中性粒细胞身份的可能性。然后，我们量化了嗜中性粒细胞亚群的代谢通路活性（图 3F 和 S3G；表 S3）。值得注意的是，HLA-DR+ 嗜中性粒细胞显示出氨基酸代谢（即缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，图 3F）的显着富集。平行地，免疫抑制性 VEGFA+SPP1+ 嗜中性粒细胞主要激活维生素代谢和 glycan 代谢。总之，这些结果支持肿瘤嗜中性粒细胞可能在代谢上协调一致，提出氨基酸代谢为主的 HLA-DR 程序的假设。³

亮氨酸代谢控制抗原呈递 machinery 的表观遗传学¶

为了系统检查氨基酸对嗜中性粒细胞的影响，我们设计了一种体外筛选策略，包括所有 20 种氨基酸，并研究了它们对来自健康捐赠者外周血嗜中性粒细胞的抗原呈递 (STAR 方法) 的影响（图 4A）。特别是，亮氨酸上调了 HLA-DR (图 4B) 和 CD80 等共刺激分子 (图 4C)。虽然精氨酸轻微上调了 HLA-DR，但它不会影响共刺激分子 (图 S4A)。我们进一步通过 PCR 阵列分析扩展了我们对亮氨酸影响抗原呈递过程的分析。值得注意的是，亮氨酸显着促进 MHC-II 复合物 assembly 的基因表达（图 4D），增强抗原加工蛋白酶（图 4E）并促进抗原加载过程（图 4F）。我们确认细胞内亮氨酸水平确实会随着亮氨酸处理而增加，并且这些影响不是由于其他抗原呈递细胞的污染所致（图 S4B）。RNAseq 分析也证实了亮氨酸对 MHC-II 而不是 MHC-I 的影响（图 4G、S4C 和 S4D）。我们还观察到亮氨酸增加了体外嗜中性粒细胞的存活率（图 S4E）。在配对的临床样本中，亮氨酸浓度也与 HLA-DR+ 嗜中性粒细胞特征呈强正相关（图 S4F；STAR 方法）。总而言之，这些数据支持亮氨酸有效启动嗜中性粒细胞抗原呈递程序的观点。

图 S4. 亮氨酸通过乙酰辅酶A/H3K27ac/MHC-II轴上调中性粒细胞中的HLA-DR，相关内容见图4 (A) 精氨酸处理的中性粒细胞与对照组之间的CD80、CD86和CCR7的MFI。中性粒细胞从健康供体的血液中分离。柱状图表示平均值±标准差。n = 3。 (B) 通过LC-MS测定亮氨酸处理的中性粒细胞和对照组的亮氨酸强度。n = 4。 (C) 基于PCR阵列的MHC-I基因（HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G）的相对RNA表达。HLA-D未检测到，因此排除在分析之外。n = 4。 (D) 基于亮氨酸处理组和对照组的RNA-seq的MHC I类特征。特征来自GO基因集数据库（STAR方法）。n = 4。 (E) 根据培养时间的活中性粒细胞率。n = 3。 (F) 匹配肿瘤样本中亮氨酸强度与HLA-DR+中性粒细胞特征的相关性（HCC，n = 4；NSCLC，n = 2；OV，n = 3；STAD，n = 1）。亮氨酸强度由匹配样本的LC-MS评估并进行对数缩放。n = 10。计算Pearson R评估相关性。 (G) 亮氨酸处理的中性粒细胞和对照组的差异代谢物分析。n = 4。精确代谢物强度见表S4。 (H) 亮氨酸处理组和对照组的ATP强度。n = 4。 (I) 亮氨酸处理组、脂多糖（LPS）和对照组的线粒体ROS MFI。n = 5。 (J) 亮氨酸处理组、LPS和对照组的线粒体质量（NAO）MFI。n = 5。 (K) 亮氨酸处理组、LPS和对照组的线粒体Ca+（Fluo3）MFI。n = 5。 (L) 亮氨酸处理的中性粒细胞与对照组之间的线粒体膜电位比较。n = 5。 (M) 亮氨酸处理的中性粒细胞与对照组之间的线粒体长度比较。长度通过透射电子显微镜测量并使用ImageJ分析计算。 (N) 亮氨酸处理的中性粒细胞与对照组之间的NAD强度比较。n = 3。 (O) 左侧面板：根据线粒体呼吸复合物I抑制的线粒体膜电位（TMRE）MFI。右侧面板：各组（未处理，1小时和2小时）中根据线粒体呼吸复合物I抑制的HLA-DR+中性粒细胞比例。n = 3。 (P) 线粒体呼吸复合物抑制包括氰化m-氯苯腙（CCCP）、寡霉素和氰化4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）时线粒体膜电位（TMRE）MFI的倍数变化。n = 3。 (Q) NAD补充中性粒细胞和对照组之间的HLA-DR MFI。n = 3。 (R) 基于亮氨酸处理组和对照组的RNA-seq数据的泛酸和辅酶A生物合成特征。特征来自KEGG数据库。n = 4。 (S) 亮氨酸处理组、乙酰辅酶A激活和对照组的组蛋白H3 MFI。n = 5。 (T) 亮氨酸和对照组在转录因子RFX5位点和MHC-II超级增强子位点上的H3K27ac修饰。为了可视化，合并了复制。 (U) 亮氨酸和对照组在HLA-DQB1和转录因子RFX5位点上的染色质可及性。染色质可及性通过ATAC-seq确定。柱状图中的数据表示为平均值±标准差（A，I–L，O–Q和S）和平均值±标准误（E）。ns表示不显著，p < 0.05，##和p < 0.01，###和p < 0.001；学生t检验（A，C，E，I–M，O，P，Q和S），配对学生t检验（B，D，H，N和R）和Wilcox检验（T）。

为了探究亮氨酸如何影响代谢组并驱动抗原呈递程序，我们进行了非靶向代谢组学分析，观察到 ATP 和脂肪酸的产生存在显著差异（图 4H、S4G 和 S4H；表 S4），部分与文献相一致 [38] 。考虑到 ATP 的产生主要发生在粒线体中 [39, 40]，我们假设亮氨酸可能通过线粒体触发功能或表型重塑。事实证明，亮氨酸处理导致线粒体聚集和改变表型（即线粒体质量、钙离子 (Ca+) 和活性氧 (ROS) 产生）（图 4I 和 S4I-S4L）。为了测试亮氨酸对线粒体的动态影响，我们检测了实时耗氧率 (OCR) 的变化，并观察到亮氨酸刺激显着增加了线粒体 OCR（图 4J）。透射电子显微镜 (TEM) 分析显示，亮氨酸处理可诱导线粒体形态特徵的改变，例如线粒体长度更长，膜上伪足更多（图 4K 和 S4M），表明细胞间接触潜能增加 [41]。这些数据部分支持线粒体代谢在调节专业抗原呈递细胞中的作用的报道 [42]。

鉴于线粒体呼吸和电子传递链机制的复杂性，我们探索了亮氨酸对特定线粒体亚组分的因果关系。通过量化单个 HLA-DR+ 中性粒细胞的线粒体呼吸特征（图 4L），我们观察到复合物 I 能够将电子从还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 转移并产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) [43]，在亮氨酸处理后表现出更高活性。然而，复合物 III 和 IV 的特征活性较弱或中等。这一观察结果得到了亮氨酸处理的中性粒细胞产生更强 NAD 输出的支持（图 S4N）。因此，我们抑制了复合物 I 活性，并观察到线粒体膜状态和 HLA-DR+ 中性粒细胞比例降低（图 4M 和 S4O）。其他线粒体呼吸抑制剂也显示出相似的结果（图 S4P）。相反，NAD 补充剂导致更高的 HLA-DR 强度（图 S4Q），进一步证实了亮氨酸在线粒体呼吸依赖性 HLA-DR 程序中的功能。

我们接下来探讨了亮氨酸是如何代谢并增强 HLA-DR 表达的。首先，我们用 13C 同位素标记的亮氨酸处理来自健康供体外周血的中性粒细胞，并追踪了亮氨酸的代谢途径。结果表明，亮氨酸代谢为乙酰辅酶 A (acetyl-CoA)，并进入三羧酸循环 (TCA) 产生更多的谷氨酸和谷胺酰胺（图 4N），这与文献报道的代谢途径一致 [44]。同时，亮氨酸处理过程中，CoA 生物合成的相关信号增强（图 S4R），并且乙酰辅酶 A 激活剂显著上调了 HLA-DR 表达（图 4O）。抑制乙酰辅酶 A 则显著降低了 HLA-DR 水平，而补充乙酰辅酶 A 又恢复了 HLA-DR 表达，这表明乙酰辅酶 A 依赖性调控着 HLA-DR 的表达。由于乙酰辅酶 A 和组蛋白 H3 的赖氨酸 27 位乙酰化 (H3K27ac) 之间存在已知的关联 [45-47]，我们检测了总的 H3K27ac 水平，观察到亮氨酸处理后 H3K27ac 增加（图 4P），组蛋白 H3 本身没有变化（图 S4S）。此外，CUT&Tag 检测显示 MHC-II 基因附近的 H3K27ac 显著上调（图 4Q），而 H3K27me3 和 H3K4me3 则没有明显变化（图 4R 和 4S）。这些数据支持了亮氨酸可以通过影响 H3K27ac 修饰从而激活 MHC-II 基因 (HLA-DRA 和 HLA-DQB1) 及其调控元件 (MHC-II 超增强子 [48]) 的概念（图 4T 和 S4T）。同时，亮氨酸处理也增强了 MHC-II 基因的染色质可及性（图 S4U）。总之，我们的研究数据表明，亮氨酸代谢依赖性地通过线粒体重塑和乙酰辅酶 A/H3K27ac/MHC-II 轴等代谢 - 表观遗传调控启动抗原呈递机制。

Figure 4: 亮氨酸通过代谢 - 表观遗传调控促进 HLA-DR+ 中性粒细胞生成 A. 筛选策略: - 研究人员筛选了 20 种氨基酸，以查看它们是否影响中性粒细胞与免疫功能相关的特征 (免疫表型)。 B. 亮氨酸和 HLA-DR+ 中性粒细胞: - 与不含亮氨酸的对照组相比，亮氨酸处理增加了表达 HLA-DR 的中性粒细胞比例。 - 图表显示了用每种氨基酸刺激后 HLA-DR+ 中性粒细胞的百分比。 C. 亮氨酸和中性粒细胞活化标志物: - 亮氨酸处理增加了中性粒细胞上 CD80、CD86 和 CCR7 的表达，这些都是与中性粒细胞活化相关的标志物。 D-G. 亮氨酸和 MHC-II 表达: - 亮氨酸处理增强了中性粒细胞中 MHC-II 复合体组装、抗原加工和 MHC-II 抗原载体的相关基因表达。 - MHC-II 分子对于将抗原呈递给 T 细胞至关重要。 - RNA 测序 (RNA-seq) 分析证实，亮氨酸处理的中性粒细胞中 MHC-II 类特征增加。 H. 亮氨酸和中性粒细胞代谢: - 亮氨酸处理改变了中性粒细胞的代谢物谱。突出显示了具有统计学显著差异的特定代谢物。 I-K. 亮氨酸和中性粒细胞线粒体功能: - 亮氨酸处理增加了中性粒细胞的线粒体聚集和耗氧速率，表明线粒体活性增强。 - 透射电子显微镜图像显示了亮氨酸组和对照组线粒体形态的差异。 L. 亮氨酸和线粒体呼吸: - 单细胞 RNA 测序数据分析显示，HLA-DR+ 中性粒细胞中线粒体呼吸链相关基因上调。 - 抑制线粒体复合体 I 活性会降低 HLA-DR+ 中性粒细胞的数量。 M. 亮氨酸代谢途径: - 亮氨酸分解成乙酰辅酶 A，为三羧酸循环 (TCA) 和谷氨酰胺合成提供燃料。 N-O. 亮氨酸和乙酰辅酶 A 在中性粒细胞发育中的作用: - 亮氨酸可能通过依赖乙酰辅酶 A 的途径促进 HLA-DR+ 中性粒细胞的生成。 - 堵塞或激活该途径会影响 HLA-DR+ 中性粒细胞的比例。 P-R. 亮氨酸和表观遗传调控: - 亮氨酸处理增加了中性粒细胞中组蛋白 H3K27ac 的水平，组蛋白 H3K27ac 是基因活跃表达的标志。 - 亮氨酸处理改变了 MHC-II 基因转录起始位点 (TSS) 周围的组蛋白修饰模式 (H3K27ac、H3K27me3 和 H3K4me3)。 - 这些表观遗传变化可能有助于亮氨酸处理的中性粒细胞中 MHC-II 表达增加。 S-T. 亮氨酸和特定 MHC-II 基因: - 亮氨酸处理增强了 HLA-DRA 和 HLA-DQB1 基因上的 H3K27ac 修饰，这两者参与 MHC-II 复合体的形成。

HLA-DR+ 中性粒细胞在空间上与 T 细胞反应相互关联并促进其反应¶

由于 HLA-DR+ 中性粒细胞有利于预后，我们研究了其潜在抗肿瘤作用的机制。首先，我们对配对的肿瘤样本进行 bulk RNA-seq 分析，解卷积了 18 种免疫细胞谱，对免疫细胞比例进行聚类，并观察到了成型的中性粒细胞 -T 细胞浸润模式 (图 5A 和 S5A)。特别是，HLA-DR+ 中性粒细胞与广泛的抗肿瘤 T 细胞亚群 (即 CD4+ 效应记忆性 T 细胞、CD8+ 效应记忆性 T 细胞和 CD8+ 中央记忆性 T 细胞) 共定位。我们获取了来自 9 种癌症类型 (BRCA、SKCM、CESC、COAD、OV、PRAD、LGG、HCC 和 RCC，表 S5) 的 50 个空间转录组学数据集，涵盖 178,330 个斑点，并计算了 HLA-DR+ 中性粒细胞和主要免疫谱系之间的相关性 (STAR 方法)。CD8+ T 细胞和 CD4+ T 细胞在主要谱系中排名靠前 (图 S5B)。值得注意的是，在 RCC 样本 (GSM5924040) 中，CD8+ T 细胞与 HLA-DR+ 中性粒细胞表现出强烈的共定位，在卵巢癌 (OV) (10x) 和结直肠癌 (CRC) (OEP001756) 样本中也观察到了类似的结果 (图 5B)。这些观察表明，抗原呈递中性粒细胞在空间上与 T 细胞相关联。⁴

为了破译 HLA-DR+ 中性粒细胞对 T 细胞的影响，我们将中性粒细胞亚群 (从肿瘤中分离) 与自体 CD3+ T 细胞 (从 PBMC 中分离) 共培养 3 天，结果表明 HLA-DR+ 中性粒细胞可以促进 T 细胞表达 TNFa (图 5C)。鉴于它们具有抗原呈递能力，我们接下来量化了单细胞水平的等位基因特异性 HLA 基因表达 (图 5D 和 S5C)。HLA-DRB1、HLA-DPA1 和 HLA-DQB1 显示出高频表达，这些位点据报道具有 T 细胞表位限制性反应性 (HLA-DRB1_09:01)49 或细胞因子产生 (HLA-DPB1_05:01)50。

我们使用 OVA 荧光蛋白进一步证实了 HLA-DR+ 中性粒细胞的抗原摄取能力 (图 S5D 和 S5E)。因此，我们用人类 MHC-II 抗原 (gp100、44–59; CMV、65–71) 喂养中性粒细胞，然后与自体 T 细胞共培养 (图 5E)。值得注意的是，分离的 HLA-DR+ 中性粒细胞诱导了自体 T 细胞的抗原特异性反应，尽管比阳性对照 (DC) 弱一些。这些数据自然地提出了一种可能性，即 HLA-DR+ 中性粒细胞可能会呈递肿瘤新抗原并引发反应性 T 细胞反应。

为了验证这一假设，将 HLA-DR+ 中性粒细胞与源于突变的的新抗原 (TP53、KRAS、IDH2 和 BAP1)51-53 孵育 24 小时，然后与自体 CD3+ T 细胞共培养 (图 5F)。我们观察到大多数新抗原刺激了 T 细胞反应，尽管不同供体之间反应存在差异。例如，KRASG12V 新抗原 (MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLI)53 在供体 2 和 3 中与中性粒细胞触发的 T 细胞激活强烈相关。我们报道的 KRASG12D 新抗原 (LVVVGADGV)52 也导致了反应性 T 细胞反应。着眼于这两个肽，我们进行了共培养实验，其中控制了中性粒细胞与 T 细胞的比例以及肽的浓度 (HLA-DRB1_07:01 和 HLA-A_02:01 类型供体) (图 5G)。当 HLA-DR+ 中性粒细胞与 T 细胞的比例为 10:1 时，KRASG12V 或 KRASG12D 新抗原激活了有效的 T 细胞新抗原反应。通过对 KRASG12V 新抗原激活的 T 细胞的 TCR 谱进行测序，我们观察到与 HLA-DR+ 中性粒细胞刺激 (阴性对照，单独的 T 细胞；阳性对照，自体 DC) 具有强烈的反应性 TCR 基因重排 (图 5H 和 S5F)，这与 DC 相 comparable (图 5I)。我们最终验证了反应性 T 细胞 (CD39+CXCL13+CD4+ T 细胞和 CD39+CXCL13+CD8+ T 细胞) 和抗原呈递中性粒细胞 (HLA-DR+CD15+ 中性粒细胞) 在多癌种组织微阵列 (TMA) 队列中的共定位 (图 5J 和 S5G)。总之，这些数据表明，抗原呈递中性粒细胞可以有效地产生反应性 T 细胞反应。

我们接下来探讨了中性粒细胞诱导的 T 细胞活化是否依赖于抗原。通过将 Leu 辛刺激的中性粒细胞与来自健康供体的自体 T 细胞共培养（在中性粒细胞刺激 24 小时后去除 Leu 辛），我们观察到持续但略弱的 T 细胞活化（图 S5H）和对源自多种癌症的细胞系的杀伤能力（图 S5I）。这提示 HLA-DR+ 中性粒细胞可能以非特异性方式激活 T 细胞。

随后，我们测试了不同的共培养方法（即在培养基中、transwell 氏腔室中或直接共培养），并检测了 T 细胞活化水平（图 S5J）。有趣的是，只有直接共培养与 T 细胞活化相关，而通过培养基或 transwell 系统培养不起作用。我们还对中性粒细胞相关细胞因子进行了 нейтрализация (zhōu hé huà，neutralization) 处理，但没有观察到 T 细胞免疫表型的变化（图 S5K）。这些结果表明，HLA-DR+ 中性粒细胞可能主要通过配体 - 受体相互作用直接激活 T 细胞。

为了识别驱动 T 细胞活化的配体，我们根据相互作用频率和基因表达百分比对计算机模拟结果进行了排序，并关注 ICAM1 和 CXCL10 等候选配体（图 S5L 和 S5M）。抑制 ICAM1 及其与 ITGAL 的相互作用后，我们观察到 T 细胞活化显着降低（图 S5N）。同时，ICAM1 和 HLA-DR 在中性粒细胞上共表达并被 Leu 辛共同上调 (co-upregulated)（图 S5O）。相比之下，抑制 CXCL10 对 T 细胞活化几乎没有影响（图 S5N）。

综上所述，HLA-DR+ 中性粒细胞可能通过 ICAM1 配体 - 受体相互作用直接激活 T 细胞，并且这种激活可能独立于特异性抗原。HLA-DR+ 中性粒细胞激活 T 细胞的能力提示了它们在抗肿瘤免疫反应中的潜在作用。

Figure 5. HLA-DR+ 中性粒细胞及其相关的 T 细胞反应

A. 免疫细胞类型与中性粒细胞亚群的相关性 - 使用 RNA-seq 估计数据分析了免疫细胞类型与中性粒细胞亚群之间的相关性。 (n = 25) B. HLA-DR+ 中性粒细胞与 CD8+ T 细胞的空间共定位 - 肾透明细胞癌 (RCC)、卵巢癌 (OV) 和结直肠癌 (CRC) 样本中，HLA-DR+ 中性粒细胞特征与 CD8+ T 细胞在空间上的共定位分析。 (***p < 0.001; Spearman-Rho 检验) C. 肿瘤浸润的 HLA-DR+ 中性粒细胞共培养 T 细胞的 TNFα 表达 - 与肿瘤浸润的 HLA-DR+ 中性粒细胞共培养的 T 细胞，其 TNFa 表达强度 (CD3+ T 细胞门控) 高于未共培养的对照组。柱状图表示平均值 ± 标准差。 (n = 4) - 中性粒细胞和自体 T 细胞分别从肿瘤 (肝细胞癌和结肠腺癌) 和匹配的血液样本中分离。 (ns，不显著，***\p < 0.001; 学生 t 检验) D. 肿瘤浸润中性粒细胞的 MHC-II 等位基因定量 - 基于单细胞 RNA-seq 数据对肿瘤浸润中性粒细胞的 MHC-II 等位基因进行定量。 E. T 细胞反应性 (4-1BB 表达强度) - 用经过亮氨酸处理的中性粒细胞 (HLA-DR+ 中性粒细胞)、未经处理的中性粒细胞 (HLA-DR- 中性粒细胞)、自体 DCs 或阴性对照共培养 T 细胞，并添加 MHC-II 肽 (gp100, 44–59; CMV, 65–71) 后检测 T 细胞反应性。 F. T 细胞杀伤力 (TNFa 表达强度) - 喂养新抗原的 HLA-DR+ 中性粒细胞与 T 细胞共培养后，检测 T 细胞的细胞毒性。自体亮氨酸诱导的 HLA-DR+ 中性粒细胞、自体 DCs 和 T 细胞均从健康供体的血液中分离。 (n = 3) G. 不同条件下 T 细胞反应性 - 喂养不同浓度的 KRASG12V (MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLI) 或 KRASG12D (LVVVGADGV) 新抗原的 HLA-DR+ 中性粒细胞与 T 细胞，并以不同的 NEU:T ratios (中性粒细胞:T 细胞比例) 进行共培养，检测 T 细胞反应性 (4-1BB 表达强度)。 H 和 I. TCR 互换及克隆型比例 - 用喂养 KRASG12V 新抗原 (MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLI) 的 HLA-DR+ 中性粒细胞或 DCs 刺激的 T 细胞进行 TCR 互换 (H) 和 TCR 克隆型比例 (I) 分析。同时加入 CD3/CD28 Dynabeads (与 T 细胞比例为 4:1)，共培养 7 天。 (n = 4) 排除质量控制不合格的样本。 J. HLA-DR+ 中性粒细胞和反应性 CD4+ T 细胞之间的关联 - 利用多癌种组织微阵列 (TMA) 队列 (涵盖 8 种癌症类型) 中的 mIHC 技术，研究 HLA-DR+ 中性粒细胞 (HLA-DR+CD15+) 和反应性 CD4+ T 细胞 (CXCL13+CD39+CD4+) 之间的关联。尺度条，30 毫米。右侧面板代表 HLA-DR+ 中性粒细胞阳性/阴性样本中 CD39+CXCL13+CD4+ T 细胞的数量。 (n = 62，排除低质量图像) (***p < 0.001; 学生 t 检验)

利用基于中性粒细胞的免疫疗法激活肿瘤微环境¶

一个关键问题是 HLA-DR+ 中性粒细胞是否有潜力在体内增强免疫疗法效果。为此，我们首先通过收集来自 7 种小鼠癌症类型的 scRNA-seq 数据评估了小鼠肿瘤微环境 (TME) 中中性粒细胞亚群的保守性 (详情见附加表格 S5)。如图 6A 所示，我们观察到小鼠体内也存在类似的亚群，例如 Cd74+、Spp1+Vegfa+ 和 Isg15+ 中性粒细胞，这与最近的报道一致 (图 S6A)。

我们进一步观察到 Cd74+ 亚群中存在 H2-Aa (HLA-DQA 同源物)、H2-Ab1 (HLA-DQB1 同源物)、Cd74 (CD74 同源物) 的表达以及抗原呈递特征 (图 6B)，并利用 mIHC 技术证实了这一亚群 (图 6C)。这些结果不仅强调了抗原呈递中性粒细胞的保守作用，还暗示了可以在体内研究这些细胞亚群的可能性。

Figure 6. 抗原呈递中性粒细胞与体内相关免疫表型的相关性 (A) 小鼠肿瘤浸润中性粒细胞的 UMAP 集成分析，根据其标志物基因和癌症类型进行分类，并与人类中性粒细胞亚群进行比较。 (B) 小鼠中性粒细胞的抗原呈递基因表达及其特征。 (C) Cd74+ 中性粒细胞的代表性 mIHC 图像 (LLC、MC38 和 Hepa 1-6)。尺度条，50 微米。 (D) 来自 LAT1KO、Bcat2KO、DbtKO 和野生型小鼠血液的亮氨酸处理组和对照组中性粒细胞的 Cd74+ 比例。 n = 4。 (E) MHC-IIflox/flox；Ly6GCre-tdTomato 小鼠和野生型小鼠的肿瘤体积比较 (MHC-IIflox/flox Ly6GCre-tdTomato：LLC，n = 10；Hepa 1-6，n = 8，MC38：n = 10；野生型：LLC，n = 9；Hepa 1-6，n = 10，MC38：n = 10)。 (F) MHC-IIflox/flox；Ly6GCre-tdTomato 小鼠和野生型小鼠的瘤内 Cd8a+T 细胞和 Cd4+T 细胞比例，分别来自 LLC、MC38 和 Hepa 1-6 皮下模型。样本分别在第 16 天 (MC38 和 Hepa 1-6) 和第 18 天 (LLC) 收集。 (G) 使用流式细胞术检测亮氨酸饮食对 LLC、MC38 和 Hepa 1-6 皮下模型中瘤内中性粒细胞的 Cd74+ 比例诱导升高 (亮氨酸组：LLC，n = 7；Hepa 1-6，n = 7，MC38：n = 7；野生型组：LLC，n = 8；Hepa 1-6，n = 8，MC38：n = 8)。样本在第 12 天收集。 (H) 亮氨酸饮食组和对照组在 LLC、MC38 和 Hepa 1-6 皮下模型中的瘤内 Cd8a+T 细胞和 Cd4+T 细胞比例。样本在第 12 天收集。 (I) 亮氨酸饮食组和对照组在 LLC、MC38 和 Hepa 1-6 组中 CD4 和 CD8a 阳性细胞的代表性 mIHC 图像。尺度条，50 微米。样本在第 12 天收集。

鉴于上文论证了亮氨酸的作用，我们体外用亮氨酸刺激小鼠循环中性粒细胞，观察到 Cd74、Cd80 和 Cd86 的上调 (图 6D 和 S6B)。然而，缺乏亮氨酸转运蛋白或分解代谢酶 (Lat1KO、Bcat2KO 和 DbtKO) 的基因敲除小鼠的循环中性粒细胞对亮氨酸治疗没有反应 (图 6D)，这再次支持了亮氨酸在 MHC-II 过程中发挥作用。

随后，我们研究了抗原呈递中性粒细胞与肿瘤表型之间的体内关联。首先，我们构建了 MHC-IIflox/flox；Ly6GCre-tdTomato 小鼠，特异性删除抗原呈递中性粒细胞 (图 6E 和 S6C)，皮下注射小鼠癌细胞 (LLC、MC38 和 Hepa 1-6)，观察到肿瘤生长增加。有趣的是，MHC-IIflox/flox；Ly6GCre-tdTomato 组的瘤内 Cd4 和 Cd8 T 细胞浸润均显着减少 (图 6F)。接下来，我们尝试通过给小鼠富含亮氨酸的饮食 (水中的亮氨酸含量为 1.5%) 来增加体内抗原呈递中性粒细胞，并观察到 Cd74+ 中性粒细胞增加 (图 6G)，但这种短期饮食并未影响肿瘤体积或体重 (图 S6D 和 S6E)。我们还测试了其他氨基酸 (精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺和色氨酸)，但没有发现持续增加 Cd74+ 中性粒细胞 (图 S6F)。

我们使用 scRNA-seq 进一步分析了亮氨酸饮食对 TME 的影响 (图 S6G)，这证实了亮氨酸治疗后 Cd74+ 比例的增加 (图 S6H)。除了抗原呈递之外，经过亮氨酸刺激的中性粒细胞还表现出上调的趋化因子和 Toll 样受体通路 (图 S6I)。在癌细胞本身 (图 S6J) 内，亮氨酸代谢特征也上调，伴随着上皮 - 间质转化和 TNFα 的强烈活性。

鉴于 CD74+ 中性粒细胞可以激活 T 细胞，我们检查了 T 细胞浸润情况，并观察到其浸润增加 (图 6H 和 6I)。总而言之，这些数据表明短期亮氨酸饮食对 TME 有益，并诱导癌细胞表型的轻微变化，提高了其潜在治疗应用前景。

接下来，我们探索了 Cd74+ 中性粒细胞在小鼠癌症中的治疗效果。值得注意的是，亮氨酸饮食联合抗 PD-1 疗法显著降低了肿瘤体积并实现了疾病稳定 (图 7A)。相反，中性粒细胞缺失降低了这种联合疗法的疗效 (图 S7A)。我们还研究了将抗原呈递中性粒细胞递送至肿瘤微环境 (TME) 作为另一种治疗方案。

我们分离了小鼠循环中性粒细胞，使用亮氨酸刺激它们，并确认了 CD74 表达上调。将这些 Cd74+ 中性粒细胞输送至肿瘤可显著减小肿瘤体积，但仍未达到疾病稳定的效果 (图 7B)，即使增加中性粒细胞的数量到 1×107 (图 S7B) 也无效。当输送缺乏 Cd74 的中性粒细胞时，我们发现抗肿瘤效果显著降低 (图 7B)。我们还评估了将 Cd45.1 小鼠的抗原呈递中性粒细胞输送至 Cd45.2 小鼠之后的中性粒细胞寿命，推测其半衰期可能更长 (图 S7C)。

将抗 PD-1 抗体与 Cd74+ 中性粒细胞输送联合使用 (图 7C) 后，我们在所有肿瘤模型中观察到了强劲的抗肿瘤效果。值得注意的是，在 MC38 和 Hepa 1-6 模型中，有相当一部分肿瘤表现出完全缓解 (MC38：4/10；Hepa 1-6：6/10)。相比之下，Cd74 基因敲除的中性粒细胞与抗 PD-1 联用显示出较弱的疗效。

最后，我们研究了临床免疫治疗数据中的抗原呈递中性粒细胞。在 8 个接受免疫治疗的队列中，涵盖了皮肤鳞状细胞癌 (SKCM)、胃肠道间质瘤 (STAD)、肝细胞癌 (HCC)、膀胱癌 (BLCA) 和非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者，我们观察到 HLA-DR+ 中性粒细胞特征与更好的生存期或治疗反应之间存在显著的正相关 (图 7D 和 7E)。接下来，我们按照患者来源肿瘤片段 (PDTF) 策略，对接受抗 PD-1 免疫治疗耐药的 HCC 样本进行了自体输送实验。经过 3 天的共培养，CD4 和 CD8 T 细胞均上调了细胞毒性分子 (IFNγ 和 TNFα) 以及反应分子 (4-1BB 和 CD39) (图 7F)。联合使用抗原呈递中性粒细胞和 PD-1 抗体还能产生更强的 T 细胞反应性和细胞毒性 (图 7G)。

Figure 7. 抗原呈递中性粒细胞治疗价值的评估 (A) 亮氨酸饮食联合抗 PD-1 治疗、亮氨酸饮食联合同型对照治疗、单独抗 PD-1 治疗和对照组的肿瘤体积。 n = 10。 (B) Cd74+ 中性粒细胞过继性输送、Cd74 基因敲除小鼠中性粒细胞过继性输送和对照组的肿瘤体积。对照组与 Figure 7A 的对照组相同。 n = 10。 (C) Cd74+ 中性粒细胞过继性输送联合抗 PD-1 治疗、Cd74 基因敲除小鼠中性粒细胞过继性输送联合抗 PD-1 治疗和单独抗 PD-1 治疗组的肿瘤体积。单独抗 PD-1 治疗组与 Figure 7A 中相同。Cd74+ 中性粒细胞过继性输送组与 Figure 7B 中相同。图 7A-7C 的数据在同一批次进行。n = 10。 (D 和 E) HLA-DR+CD74+ 中性粒细胞特征与接受免疫治疗患者的生存期 (D) 和治疗反应模式 (E) 之间的相关性。 (F 和 G) 不同细胞数下，自体 HLA-DR+ 中性粒细胞和 HLA-DR 缺陷型中性粒细胞刺激 PDTF 模型中的 CD4+ 细胞 (上图) 和 CD8+ 细胞 (下图) 中 4-1BB+、CD39+、GZMB+、IFNg+ 和 TNFa+ 亚群的比例。 n = 5。患者血液来源的 HLA-DR+ 中性粒细胞、PD-1 抗体或两者联合使用。

讨论¶

高维度单细胞分析因其规模和解码复杂微环境的能力，彻底改变了癌症免疫学研究，并正引领着对某些细胞类型（如 T 细胞或巨噬细胞）的全器官谱分析。对于中性粒细胞而言，现在是时候构建一个统一的数据驱动框架来定义中性粒细胞本体论了。我们整合了来自 17 种癌症类型、143 名患者的 225 个样本的中性粒细胞转录组，观察到由 10 种细胞状态组成的高度转录异质性。值得注意的是，HLA-DR 程序可以通过亮氨酸处理刺激，这会诱导更高的线粒体呼吸、乙酰辅酶 A 输出以及抗原呈递基因的表观遗传激活。因此，亮氨酸饮食或过继性输送策略可以提高癌症免疫治疗的疗效，并可能作为一种潜在的中性粒细胞治疗策略。

以一种无偏的方式对人类单家中性粒细胞进行谱分析仍然是一项重大挑战。小鼠和人类中性粒细胞都寿命短暂，因此在以往的癌症单细胞谱分析研究中一直被忽视。我们分离中性粒细胞并进行单细胞测序的策略使得探索中性粒细胞状态谱、细胞亚群的异质性以及它们在整个癌症阶段的时间变化成为可能。我们跨物种整合的中性粒细胞数据可以帮助建立人类和小鼠中保守的中性粒细胞层次结构，这为应用小鼠模型探索基于中性粒细胞的疗法奠定潜在基础。

癌症 - 免疫循环由抗原呈递过程启动；然而，肿瘤微环境 (TME) 内受損的抗原呈递机制，例如 DC 功能障碍和 HLA 下调，可导致免疫逃逸。我们利用高分辨率绘图方法将 HLA-DR+CD74+ 中性粒细胞识别为各种癌症类型中的替代抗原呈递细胞。2016 年在早期肺癌中发现了类似的中性粒细胞亚群，另一个独立小组最近报道抗 FcgRIIIB- 抗原复合物可以将中性粒细胞转化为抗原呈递细胞。与这种功能可塑性相一致，我们的工作进一步提供了抗原呈递代谢调控的证据，证明氨基酸在促进中性粒细胞抗原呈递中的作用，而脂肪酸或葡萄糖营养压力则在调节巨噬细胞抗原呈递功能中至关重要。

与树状细胞、B 细胞和某些巨噬细胞亚群等其他专业抗原呈递细胞相比，表达 HLA-DR 的中性粒细胞在某些情况下可能具有一些优势。例如，中性粒细胞通常是炎症部位最早的反应细胞之一。独特的是，中性粒细胞具有活性吞噬能力和趋化特性。这一特性使它们能够有效地迁移和降解抗原，从而加强其作为抗原呈递细胞的作用。中性粒细胞的另一个重要特征是其半衰期短，这可能会降低它们被肿瘤微环境重新编程为免疫抑制细胞的可能性。这是其他寿命更长的免疫细胞可能面临的风险。这些独特之处凸显了中性粒细胞在抗肿瘤免疫反应中的潜在价值。进一步的研究可以探索 HLA-DR+ 中性粒细胞和其他专业抗原呈递细胞之间抗原呈递能力的直接比较。

重要的是，我们的研究结果可能为更好的免疫疗法带来机会。首先，与中性粒细胞耗竭疗法不同，我们的中性粒细胞输送策略只需要自体循环中性粒细胞的分离和短期体外刺激，使其成为一种更安全的替代方案，不会使患者易受感染。其次，HLA-DR+ 中性粒细胞可以加载广泛的 (新生) 抗原，而无需复杂的基因工程，这相较于靶向抗原有限、纯化过程复杂且 T 细胞工程昂贵的 CAR-T 细胞而言具有潜在优势。然而，这种疗法的副作用仍值得研究。第三，鉴于中性粒细胞的半衰期短，这种疗法的副作用可能是暂时可控的。该特性可以使任何潜在副作用的持续时间降到最低，从而允许及时干预和改变治疗方案。需要进行全面的临床前和临床研究以充分了解这种前景广阔的疗法的安全性概况。

总之，我们的数据集为越来越多的证据提供了支持，即肿瘤内的细胞邻域对于塑造免疫反应至关重要。中性粒细胞转录组谱分析允许同时查看细胞状态是什么（通过它们表达的基因程序），以及它们如何在不同癌症类型中分布。我们的数据将有助于解开中性粒细胞亚群的细胞回路，并有可能弥合代谢、表观遗传修饰和先天免疫细胞表型之间的差距。我们的研究可能通过开发中性粒细胞疗法来调节针对（新生）抗原的免疫反应，从而有可能与现有的癌症免疫疗法形成互补。

研究的局限性¶

在各种情况下，探索肿瘤相关中性粒细胞的状态转换（例如产生 HLA-DR+ 中性粒细胞）仍然具有重要价值，这些情况包括具有不同遗传背景的肿瘤、对免疫治疗难治性肿瘤和转移性肿瘤。我们的研究样本量相对较小（例如包含 8 种癌症类型的多癌种组织微阵列队列），需要对更大队列的中性粒细胞状态进行进一步验证以支持这些发现的普遍适用性。尽管我们的研究表明亮氨酸可以增强中性粒细胞依赖性抗原呈递和抗肿瘤免疫，但富含亮氨酸的饮食潜在的不良反应仍然不清楚。此外，不同肿瘤之间亮氨酸含量差异的原因以及贫亮氨酸肿瘤中中性粒细胞的抗原呈递功能是否会丧失也尚不清楚。

此外，中性粒细胞亚群之间潜在的代谢差异仍不清楚。例如，虽然 HLA-DR+ 中性粒细胞显示亮氨酸代谢增加，但 TXNIP+ 亚群在组氨酸、精氨酸和脯氨酸代谢方面表现出独特的富集。测试中性粒细胞是否能够优先摄取或利用这些氨基酸可以深入了解它们的功能差异。

我们观察到 HLA-DR+ 中性粒细胞使 T 细胞增殖增加，还需要进一步研究它们如何直接激活 T 细胞。体外测试 T 细胞的抗原呈递以及体内分析 CD4+/CD8+ T 细胞反应可以阐明这一点。追踪过继性转移的 HLA-DR+ 中性粒细胞还可以揭示它们的迁移模式以及到达引流淋巴结的能力。尽管我们的数据表明 HLA-DR+ 中性粒细胞可以激活 T 细胞并表达高水平的 CCL5（可以募集 T 细胞），但局部中性粒细胞 -T 细胞相互作用与对 T 细胞浸润更广泛影响之间的关系还需要进一步探索。探索 T 细胞和抗原呈递中性粒细胞之间的连接和突触也很有趣，可以深入了解它们超越静态快照分析的细胞间通讯。追踪中性粒细胞在肿瘤、血液和淋巴结中的半衰期将对其临床应用提供参考信息。未来的研究应重点开发更有效的策略，将中性粒细胞重新编程为抗肿瘤状态，例如抗原呈递状态。

方法细节¶

标准化细胞分选方案¶

将肿瘤组织和匹配的正常组织解剖成直径小于 1mm 的小块，并使用胶原酶 IV (STEMCELL Technologies; 07909_C) 和 0.4 mg/mL 透明质酸酶在 RPMI 1640 (Gibco; 11875093) 中解离 60 分钟。所得细胞通过 400 微米过滤器过滤并用 DPBS 洗涤 (500g，10 分钟)。为了分离 CD66b+ 中性粒细胞，我们采用了二级分选策略。首先，用 CD66b 生物素抗体 (Biolegend, 305120) 染色细胞，然后用 MS 柱 (Miltenyi Biotec, 130-042-201) 进行分选。接下来，用 CD66b PE 抗体 (Biolegend, 305105) 对细胞再次染色，并通过流式细胞术 (BD FACS Aria II) 再次分选。分选出的细胞立即用于单细胞 RNA 测序。对于细胞数量充足的样本，我们还对 CD45+ 细胞进行分选并测序。

对于来自血液的中性粒细胞，我们将外周血与红细胞裂解缓冲液 (Sangon, B541001) 孵育 10 分钟，然后用 DPBS 洗涤 (500g，10 分钟)。然后用 CD66b PE 抗体 (Biolegend, 305105) 对所得细胞悬浮液进行染色，并使用流式细胞术 (BD FACS Aria II) 进行分选。

单细胞测序¶

使用 10x Chromium 单细胞平台和 50 个试剂盒按照制造商的协议对分选出的细胞进行测序。然后在 Illumina 的 NovaSeq 平台上对单细胞文库进行测序。为了追踪样本来源，我们使用了 BioLegend 的 TotalSeq C (399905)，它可以区分肿瘤细胞、邻近正常细胞和血液细胞。

CellRanger V7 用于处理条形码、比对数据以及生成原始 scRNA-seq 谱的初始簇。

scRNA-seq 数据质量控制、处理、注释和可视化¶

首先使用 CellRanger V7 将原始 fastq 文件比对到人类基因组 (GRCh38, ENSEMBL)，遵循 10X Genomics 中性粒细胞教程 (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/tutorials/neutrophils)，我们通过使用 “–include-introns” 参数保留内部子区域，并在 CellRanger 中设置 “–force-cells=20000”。然后，我们使用 Seurat (V4.0.4)78 处理 UMI 计数矩阵。我们使用 doubletFinder (V2.0.3) 进行双峰去除。通过 PercentageFeatureSet(object, pattern = "^MT-") 函数评估线粒体基因百分比，并去除线粒体基因百分比超过 10% 的细胞。排名前 5000 的基因被识别为高可变基因 (HVG)，用于 Seurat.78 的 FindVariableFeatures 函数，剔除之前描述的黑名单中的基因 65。我们使用 harmony (V0.1.0)79 根据样本 ID 整合所有细胞。我们执行聚类分析，并仅保留由 CSF3R、FPR1、FCGR3B、NAMPT 和 MNDA 等标记物定义的中性粒细胞，遵循 10X Genomics 中性粒细胞教程。我们进一步使用 SingleR (V1.7.1) 确认输入细胞是真正的中性粒细胞。在第二轮双峰去除中，我们观察到高表达 CD3D (T 细胞)、CD79A (B 细胞) 和 CD68 (巨噬细胞) 的簇。接下来，我们使用 Seurat.78 的 FindAllMarker 函数计算标记基因。

单细胞转录程序特征基因分析和特征量化¶

我们遵循了一项既定的计算策略，用于解码单细胞异质性。80 具体而言，我们首先使用 scTransform81 对数据矩阵进行归一化，然后逐个执行 NMF 分析（参数：k = 100）。我们对 H 矩阵的 Jaccard 索引进行聚类并使用 pheatmap (V1.0.12) 进行可视化。我们进行差异基因分析以找到每个程序的特征基因。进一步使用高表达基因进行基因集富集分析。至于特征量化，我们使用 UCell82 量化中性粒细胞的特征/通路活性。分析包括 KEGG 通路数据库，83 标志基因集，84 Gene Ontology (GO) 数据库，85 和中性粒细胞免疫表型特征。29 对于中性粒细胞特征的昼夜节律分析，采样时间是指肿瘤样本的手术时间。

单细胞 HLA 类型定量¶

我们使用 scHLAcount (V0.2.0，可从 https://github.com/10XGenomics/scHLAcount) 获得，使用默认参数计算 I 类基因 HLA-A、B 和 C 的分子数量；以及 II 类基因 DPA1、DPB1、DRA1、DRB1、DQA1 和 DQB1 的分子数量。

单细胞代谢物定量¶

为了探索 HLA-DR+ 中性粒细胞中的关键通路，我们首先计算通路方差（基尼指数、度量熵、香农熵和辛普森指数）。基尼指数的计算公式为：G = (2A) / (nB)，其中 G 为基尼指数；A 是 Lorenz 曲线和通路评分完全相等线 (图中从左下角到右上角的对角线) 之间的面积；B 是通路评分完全相等线下的总面积；n 是细胞总数。辛普森指数的计算公式为：D = 1 - S(ni(ni-1)) / N(N-1)，其中：D 为辛普森指数；ni 是给定通路中的细胞数量。香农熵的计算公式为：H = -ΣP(x)log2 P(x)，其中 H 是以比特为单位的熵，P(x) 是通路评分的概率分布。主要代谢物亚型的定量分析使用我们之前开发的 scMetabolism 进行 (参数：imputation = T，metabolism.type = "KEGG")。

细胞间通讯、细胞轨迹和细胞进化枝分析¶

为了解 HLA-DR+ 中性粒细胞如何与 T 细胞相互作用，我们首先进行降采样分析（至 20,000 个细胞），使用 ALRA86 补齐表达矩阵，然后使用 CellPhoneDB87 推断相互作用（参数：cellphonedb method statistical_analysis –iterations=100 –threads=48）。接下来，我们根据基因表达比例和频率对中性粒细胞上表达的配体进行排序。我们使用 scTour 推断中性粒细胞的分化状态。32 为了验证轨迹，我们接下来使用 monocle3、33 CytoTRACE、34 和 Slingshot35 分别推断中性粒细胞亚群的伪时间。为了比较来自血液、癌症和邻近组织的中性粒细胞的层次结构差异，我们将包含 3000 个可变基因的表达矩阵进行拆分，并使用 TooManyCells26 进行聚类分析（参数：make-tree PieRing）。

生成泛癌中性粒细胞浸润共识¶

我们使用 UCSC Xena88 下载了泛癌实体瘤的基因表达矩阵（数据类型：HTSeq - FPKM-UQ）。我们首先测试了 8 种常见的免疫量化算法，涵盖 CIBERSORT、ESTIMATE、Quantiseq、MCPCounter、IPS、TIMER、EPIC 和 xCell。16–18,89–93 我们发现其中 3 种支持量化中性粒细胞水平（MCPCounter、Quantiseq 和 xCell）。我们将泛癌样本根据这三种算法生成的中性粒细胞水平进行聚类，并根据这些评分的一致排名设计共识中性粒细胞评分。详细来说，对于在三种算法中排名上位数或下位的样本，我们将其标记为高或低中性粒细胞共识样本。而未在这三种算法中达成共识的样本则被标记为异质性样本。我们根据共识评分对样本进行排序，并按癌症类型对它们进行排序。我们还使用嵌入 Seurat78 的 t-SNE 进行降维分析，并根据其细胞内中性粒细胞的共识状态标记样本。

转录因子活性分析¶

对于 scRNA-seq 数据，我们使用 dorothea (V1.10.0) 推断转录因子活性。对于 RFX5 转录因子的 ChIP-seq，我们提取了已发布的 RFX5 ChIP-seq 数据（ accession number: SRX150635, SRX150644, SRX150384, SRX186620, SRX186634, SRX150462, 和 SRX150639），并使用 UCSC 基因组浏览器进行分析。94 通过向 HL-60 培养基中添加 1% DMSO 六天，可以获得类似中性粒细胞分化的 HL-60 (dHL-60) 细胞。25 我们从 Genemeditech (上海，中国) 获得了 RFX5 的敲低和过表达质粒。空载体用作阴性对照。每个条件进行 3 次重复实验。

多路免疫组化分析¶

我们使用以下抗体进行免疫组化：骨桥蛋白/SPP1 (Abcam; ab214050; 物种反应性：人), HLA-DR (赛默费シャー; 14-9956; 物种反应性：人), CD15 (MAB-0015; 物种反应性：人), Cd74 (Abcam; ab289885; 物种反应性：小鼠), Ly6G (Abcam; ab238132; 物种反应性：小鼠), CXCL13 (Abcam; ab246518; 物种反应性：人), CD39 (Abcam; ab300065; 物种反应性：人), CD4 (百齢恩; BX50023; 物种反应性：人), CD8 (Dako; M7103; 物种反应性：人), MPO (Abcam; ab300650; 物种反应性：人), CD11b (Abcam; ab133357; 物种反应性：人), DAPI (百優; 422801)。

我们使用 PerkinElmer Vectra3 平台扫描载玻片，并使用 PerkinElmer Vectra3 平台定量结果，如前所述。52,95-97 包括具有匹配预后元数据的 8 癌种组织微阵列队列 (HCC、COAD、NSCLC、STAD、RCC、OV、BRCA 和 BLCA) 和多癌种组织微阵列队列 (PAAD、RCC、HCC、ICC、STAD、NSCLC、BRCA 和 COAD)。详细的临床病理特征见表 S1。

细胞培养¶

我们使用 Ficoll Paque Plus 试剂 (GE, 17-1440-03) 对健康捐献者外周血进行 Ficoll 分离实验。通过 CD66b 生物素抗体 (Biolegend, 305120) 染色、添加生物素磁珠和 MS 柱分离 (Miltenyi Biotec, 130-042-201) 来分离中性粒细胞。通过 CD3 生物素抗体 (Biolegend, 300404) 染色、添加生物素磁珠和 MS 柱分离 (Miltenyi Biotec, 130-042-201) 来分离 T 细胞。将细胞 (5 × 104) 以 200 μL 培养基总量添加到 96 孔细胞培养板中。为了保持中性粒细胞活性，我们添加了浓度为 100 ng/mL 的脂多糖 (LPS, MCE, HYD1056)。此外，我们还用 20 种氨基酸补充培养基，并进行 24 小时中性粒细胞培养 (Sangon, A600022-0100、A600205-0100、A694341-0100、A600091-0250、A600132-0100、A100374-0050、A600221-0500、A610235-0500、A604351-0050、A100803-0050、A600922-0100、A602759-0025、A610346-0100、A600991-0025、A600923-0100、A601479-0100、A610919-0100、A601911-0050、A601932-0100、A600172-0025)。每种氨基酸的浓度都设置为匹配 healthmatters.io 报告的生理血浆浓度：丙氨酸 (681 mmol/L)、精氨酸 (137 mmol/L)、天冬氨酸 (90 mmol/L)、天门冬氨酸 (12.6 mmol/L)、胱氨酸 (360 mmol/L)、谷氨酰胺 (876 mmol/L)、谷氨酸 (21

流式细胞术¶

为了进行表面染色，我们将适当的抗体与细胞在室温下混合 15 分钟，然后用 DPBS (500g，10 分钟) 洗涤。对于胞内染色，我们使用固定透化试剂盒 (BD, 554714) 固定和透化细胞，然后按照之前描述的那样，在 4℃ 的透化缓冲液中用适当的抗体染色 30 分钟。98 使用以下抗体：CD66b PerCP-Cy5.5 (Biolegend 305108)、CD66b PE (Biolegend 305105)、CD66b FITC (Biolegend 305104)、HLA-DR BV421 (Biolegend 307636)、骨桥蛋白 (SPP1) eFluor660 (Invitrogen 50-9096-41)、CXCR2 A488 (Biolegend 320712)、CD62L PEcy5 (invitrogen 1946541)、CD54 (ICAM1) PE (Biolegend 322708)、CD3 APC (Biolegend 300458)、CD8a BV785 (Biolegend 301046)、CD4 APC/Fire750 (Biolegend 344638)、颗粒酶 B PE/Dazzle594 (Biolegend 372216)、IFN-g BV711 (Biolegend 502539)、TNF-a BV650 (BD 563418)、4-1BB (CD137) FITC (eBioscience 11-1379-42)、CD69 BV605 (BD 562989)、组蛋白 H3 A647 (Cell Signaling 12230S)、乙酰化组蛋白 H3 Lys27 A647 (Cell Signaling 39030S)、OVA FITC (sangon D110528)、Ly6G PE (Biolegend 127608)、Cd74 A488 (Biolegend 151006)、Cd74 A647 (Biolegend 151004)、Cd45 FITC (TONBO 35-0451-U025)、Cd3 A700 (BD 561388)、Cd8a BV711 (BD 563046)、Cd4 PEcy5 (BD 553050)、Cd62L APC (eBioscience 17-0621-83)、Cd19 PEcy7 (Biolegend 115519)、Cd11b BV395 (BD 563553)、Ly6C PerCPCy5.5 (eBioscience 45-5932-82)、F4/80 BV785 (Biolegend 123141)、Cd279 BV421 (Biolegend 135221)、CD11c PEcy5.5 (eBioscience 35-0114-82)、CD16 BV711 (Biolegend 302044). 之后使用流式细胞术 (BD LSRFortessa) 和 Flowjo 软件 (BD) 对细胞进行进一步分析。

MHC I 类和 II 类抗原呈递基因的 PCR 阵列分析¶

我们用亮氨酸刺激来自健康捐献者血液的中性粒细胞 24 小时。然后按照制造商的说明，分别使用人类 MHC I 类抗原呈递基因表达 PCR 阵列 (Wcgene Biotech, 上海，中国) 和人类 MHC II 类抗原呈递基因表达 PCR 阵列 (Wcgene Biotech, 上海，中国) 进行基因表达谱分析。

代谢组学 LC-MS 分析和亮氨酸示踪¶

使用配备 ACQUITY UPLC® HSS T3 色谱柱 (2.1×150 mm, 1.8 µm) (Waters, Milford, MA, USA) 的 Thermo Vanquish 超高效液相系统 (Thermo Fisher Scientific, USA) 进行分析。系统运行参数为流速 0.25 mL/min、柱温 40 ℃、进样体积 2 µL。质谱数据使用配备电喷雾电离源 (ESI) 的 Thermo Orbitrap Exploris 120 质谱仪检测器 (Thermo Fisher Scientific) 采集。

数据采集使用正负离子模式，正离子喷雾电压为 3.50 kV，负离子喷雾电压为 -2.50 kV。鞘气和辅助气流量分别设置为 30 arb 和 10 arb。初扫描分辨率为 60,000，扫描范围为 m/z 100-1000，使用 HCD 进行二级碎裂，碰撞能量为 30%。二级分辨率设置为 15,000。 MS 数据分析遵循既定程序进行.99

原始 MS 数据使用 ProteoWizard 软件 (http://proteowizard.sourceforge.net) 转换为 mzXML 格式。峰提取使用 R 软件包 XCMS (V3.20.0) 完成。峰表和使用 ProteoWizard 转换的 mgf 格式 MS2 文件上传至 MetDNA 网络服务器 (http://metdna.zhulab.cn/) 进行代谢物鉴定。鉴定结果按照 MSI (代谢组学标准倡议) 准则分为 1-3 级和未知水平。

对于组织样本，10 个通过质控的 scRNA-seq 配对样本 (HCC, n=4; NSCLC, n=2; OV, n=3; STAD, n=1) 用于 LC-MS 分析。对于中性粒细胞，自体血液中性粒细胞通过 CD66b 生物素抗体 (Biolegend, 305120) 染色分离，加入生物素磁珠，使用 MS 柱 (Miltenyi Biotec, 130-042-201) 进行分离，然后用亮氨酸刺激 24 小时。

13C 亮氨酸示踪实验中，我们参照既有文献 (44) 对中性粒细胞用 L-Leucine-13C6 (Sigma 605239) 处理 24 小时。未处理的中性粒细胞作为对照。每种条件重复实验 3-4 次。

线粒体功能和表型特征分析¶

线粒体膜电位 (TMRE, Sigma 87917-25MG)、线粒体活性 (NAO nonyl bromide, Sigma A7847-100MG)、细胞内钙离子浓度 (Fluo 3, Sigma 73881-1MG)、线粒体膜电位 (JC-1, AAT Bioquest 22200) 和活性氧簇 (ROS, AAT Bioquest 16051) 检测试剂与中性粒细胞在室温下混合孵育 30 分钟，之后使用 DPBS (500g，10 分钟) 洗涤细胞。然后使用流式细胞仪 (BD LSRFortessa) 和 Flowjo 软件 (BD) 分析细胞，同时利用莱卡 TCS SP5 激光共聚焦显微镜成像中性粒细胞线粒体。每种条件重复实验 3 次。

Seahorse 细胞代谢分析仪检测¶

自体血液中性粒细胞通过 CD66b 生物素抗体 (Biolegend, 305120) 染色分离，加入生物素磁珠，并使用 MS 柱 (Miltenyi Biotec, 130-042-201) 进行分离纯化。分离后，中性粒细胞用亮氨酸刺激 24 小时。培养板中加入 5 × 10⁵ 个分离自健康捐赠者血液的中性粒细胞，并用亮氨酸刺激 24 小时。之后，根据制造商的说明，使用 XF24 Seahorse 细胞代谢分析仪测量细胞的氧消耗率 (OCR)。实验中，使用寡霉素 (oligomycin, 0.25 mM)、FCCP (0.25 mM)、鱼藤酮 (rotenone, 0.25 mM) 和抗霉素 A (antimycin A, 0.25 mM) 处理中性粒细胞。每种条件重复实验 3 次。

透射电子显微镜 (TEM) 分析¶

将中性粒细胞置于暗室条件下，用 1% 的四氧化二 Os 固定于 PBS 中 2 小时，然后用 PBS (pH 7.4) 分别清洗 3 次，每次 15 分钟。之后，将细胞依次脱水于一系列梯度酒精溶液 (30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%) 中，每次 15 分钟。随后，将细胞包埋于环氧树脂中。使用超薄切片机将树脂块切成超薄切片 (60-80 nm)，并收集在 150 目的铜网上。将铜网置于暗室条件下，用饱和酒精溶液中的 2% 醋酸铀酰铀染色 8 分钟，用 70% 酒精清洗 3 次，再用超纯水清洗 3 次，然后用 2.6% 的柠檬酸铅染色 8 分钟。每组实验用透射电子显微镜观察 5 个细胞。使用日立 SUHT7700 电子显微镜成像，然后用 ImageJ Fiji (V2.11.0) 分析图像。具体而言，我们使用“直线”工具测量线粒体长度。导出的长度数据将用 R 软件进行分析。

共聚焦成像¶

用 JC-1 染色中性粒细胞时，我们将细胞悬浮于染色液中，于 37 摄氏度孵育 30 分钟。去除染色液后，我们用实验缓冲液洗涤细胞以去除未结合的染料。然后使用奥林巴斯 SpinSR10 Ixplore 共聚焦显微镜拍摄细胞图像。随后，我们采用 ImageJ Fiji (V2.11.0) 软件分析图像。

bulk RNA-seq 分析¶

对于 scRNA-seq 配对的样本，我们将剩余的新鲜样本快速冷冻于液氮中。对于中性粒细胞样品，自体血液中性粒细胞通过 CD66b 生物素抗体 (Biolegend, 305120) 染色分离，加入生物素磁珠，并使用 MS 柱 (Miltenyi Biotec, 130-042-201) 进行分离纯化。分离后，中性粒细胞用亮氨酸刺激 24 小时。使用 Trizol (Thermo Fisher Scientific, 15596018) 从样本中提取 RNA。文库构建使用 NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit (NEB #E7490) 进行，然后使用磁珠 (AMPure XP 系统) 纯化文库。最后，使用 NovaSeq 6000 (PE150) 进行测序。比对使用 STAR 软件 (https://github.com/alexdobin/STAR)。使用 htseq-count (https://htseq.readthedocs.io/en/release_0.11.1) 计算每个基因的原始表达水平 (基于片段计数)。差异显著表达基因的选择标准为: |log2FC| > 1 且 P 值 < 0.05。中性粒细胞 RNA-seq 分析重复 4 次。

对于免疫反卷积分析，我们使用 xCell 方法。18 首先，在所测试的方法中，xCell 涵盖了最多的 T 细胞类型，为我们提供了更全面的样本中 T 细胞群体的概况。其次，xCell 是该领域中最广泛使用的免疫细胞定量方法之一。18

H3K27ac, H3K27me3 和 H3K4me3 CUT&Tag¶

自体血液中性粒细胞通过 CD66b 生物素抗体 (Biolegend, 305120) 染色分离，加入生物素磁珠，并使用 MS 柱 (Miltenyi Biotec, 130-042-201) 进行分离纯化。分离后，中性粒细胞用亮氨酸刺激 24 小时。然后进行细胞通透化、抗体孵育、标记、DNA 提取和测序步骤 (上海嘉因生物科技公司)。对于数据过滤，使用 Trimmomatic (V0.35, http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 处理原始 reads。比对使用 BWA 软件 (https://bio-bwa.sourceforge.net/)。片段大小是通过比对配对末端测序数据的 BAM 文件计算读对片段的长度。片段长度的汇总统计通过抽样几个区域来估计，具体取决于基因组大小和处理器的数量。此分析中使用 MACS2 (V2.2.7.1, https://pypi.org/project/MACS2/) 进行峰值检测，Bedtools (V2.30.0, https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/) 主要用于峰注释分析。

ATAC-seq 分析¶

自体血液中性粒细胞通过 CD66b 生物素抗体 (Biolegend, 305120) 染色分离，加入生物素磁珠，并使用 MS 柱 (Miltenyi Biotec, 130-042-201) 进行分离纯化。分离后，中性粒细胞用亮氨酸刺激 24 小时。接下来提取细胞核，并使用 Tn5 转座酶 (Illumina) 对 40,000 个细胞核进行转座反应。测序在 Illumina Novaseq6000 平台上使用 PE150 测序策略进行 (上海嘉因生物科技公司)。原始序列数据使用 Trimmomatic (V0.35，http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) 进行过滤。比对使用 BWA 软件 (https://bio-bwa.sourceforge.net/)。然后使用 BAM 文件中的比对 reads 计算读对片段的大小。片段长度的汇总统计通过抽样几个区域来估计，具体取决于基因组大小和处理器的数量。此分析中使用 MACS2 (V2.2.7.1, https://pypi.org/project/MACS2/) 进行峰值检测。最后，峰注释分析主要采用 Bedtools (V2.30.0, https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/)。

空间转录组学分析¶

我们使用 Seurat (V4.0.4) 处理了空间 ranger 输出文件。样本信息总结在附加表 S5 中。之后，我们利用 Seurat 的 SCTransform 函数进行数据归一化，RunPCA 函数进行降维，FindNeighbors 和 FindClusters 函数进行 ST spot 聚类分析。为了对细胞类型进行评分，我们使用 xCell (V1.1.0) 并利用 GSVA (V1.40.1) 估计中性粒细胞特征。

新抗原、T 细胞和中性粒细胞共培养系统¶

中性粒细胞通过 CD66b 生物素抗体 (Biolegend, 305120) 染色、添加生物素磁珠和 MS 柱分离 (Miltenyi Biotec, 130-042-201) 从健康供血者的血液中分离纯化。分离后，这些中性粒细胞用亮氨酸刺激 24 小时。然后加入合成的肽段 (10 mg/ml)，并让抗原呈递细胞 (APC) 摄取并处理 12 小时。之后，将中性粒细胞与自体外周血单个核细胞 (PBMC) 分离出的 T 细胞共培养 24 小时。使用以下中和抗体：TNFα (sinobiological, 10602-MM0N1)、IL-6 (sinobiological, 10395-R508)、IL-17 (sinobiological, 12047-M237)、IL-23 (sinobiological, CT035-mh066)、IFNg (Selleck A2041)。每种条件重复实验 3 次。

利用 TCR-seq 评价反应性 T 细胞应答¶

自体血液中性粒细胞通过 CD66b 生物素抗体 (Biolegend, 305120) 染色分离，加入生物素磁珠，并使用 MS 柱 (Miltenyi Biotec, 130-042-201) 进行分离纯化。分离后，中性粒细胞用亮氨酸刺激 24 小时。我们将亮氨酸诱导的 HLA-DR+ 中性粒细胞与自体 T 细胞 (负控制：单独 T 细胞，阳性控制：树状细胞 (DCs)) 和 KRASG12V 新抗原肽段 (MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLI) 共培养 7 天 (来自 4 位供体)。同时加入 CD3/CD28 Dynabeads (T 细胞为 4:1)。随后对 T 细胞进行 TCR-seq 分析。取每个样品 2mg 总 RNA 用于制备 T 细胞受体 (TCR) 测序文库。该过程使用 KC-Digital® 双链特异性 TCR 测序文库构建试剂盒 (由武汉 Seqhealth Technology 有限公司提供，货号 DT0813-02) 进行，遵循制造商的说明书。文库片段长度为 250-500bp，经过富集和定量后，使用 Illumina NovaSeq 平台进行测序。去除 PCR 扩增引入的序列，然后利用 TRUST4 软件 (https://github.com/liulab-dfci/TRUST4) 将序列比对到 IMGT 数据库。最后，使用 immunarch (V1.0.0, https://immunarch.com/) 软件对数据进行分析和可视化展现。

图 S1. 全癌种单中性粒细胞生成、抽样策略和程序解码，相关于图 1

(A) TCGA 数据集中泛癌种样本的中性粒细胞浸润水平。 n = 8766。癌症类型缩写见表 S1。 (B) CPTAC 数据集中泛癌种样本中性粒细胞浸润水平的验证。 n = 1033。癌症类型缩写见表 S1。左侧面板代表整个癌种的中性粒细胞浸润。中间面板代表癌症类型。右侧面板代表整个癌种的中性粒细胞浸润一致性评分排序。 (C) 两个队列 (TCGA 和 CPTAC) 中中性粒细胞浸润水平之间的相关性。横轴和纵轴分别代表使用中性粒细胞浸润一致性评分、MCPCounter 中性粒细胞评分、Quantiseq 中性粒细胞评分和 xCell 中性粒细胞评分后的 TCGA 和 CPTAC 数据中的平均中性粒细胞浸润水平。 (D) 本研究纳入的肿瘤样本数量与 TCGA 数据之间中性粒细胞浸润水平之间的相关性。横轴代表 TCGA 数据中的中性粒细胞浸润水平的中值。纵轴代表本研究纳入的患者。 (E) 流式细胞术分选的中性粒细胞门控策略。 (F) 来自不同癌种的中性粒细胞亚群的 UMAP 图。颜色代表每个中性粒细胞亚群。为了便于可视化，移除了中性粒细胞少于 500 个的癌种。 (G) 使用 NMF 分析的中性粒细胞转录程序 (见 STAR 方法)。上面板代表转移状态和癌症类型。颜色代表每个程序的相关值。右侧文本代表每个程序富集的术语。 (H) 本研究中的中性粒细胞亚群与已发表的人类中性粒细胞状态的比较。7,22–25

图 S2. 与图 2 相关的中性粒细胞亚群转录组特征

(A) 不同样本类型的中性粒细胞亚群浸润水平。颜色代表 Ro/e 值 (观察到的细胞数量与预期细胞数量的比率)。较大的 Ro/e 值表示浸润增加。大于 2 的 Ro/e 值归一化为 2。 (B) NSCLC、BRCA 和 HCC（富含 HLA-DR+ 中性粒细胞的癌种）中与图 2D 所示的苏木素染色区域匹配，以及 STAD、RCC 和 ICC（富含 SPP1+ 中性粒细胞的癌种）。规模栏，30 毫米。 (C) 利用 8 癌种组织微阵列 (TMA) 队列中的 mIHC 定量验证 SPP1+CD15+ 中性粒细胞在 COAD、NSCLC、HCC、STAD、RCC、卵巢癌 (OV)、BRCA 和 BLCA 中的预后价值。 SPP1+CD15+ 与 CD15+ 中性粒细胞比例的截止值由 R 软件包 survival 和 survminer 确定，p 值由 log-rank 检验确定。 (D) 不同中性粒细胞亚群之间差异表达的增殖基因和干扰素相关基因的表达谱。 (E) 根据采样时间的中性粒细胞相关特征的昼夜节律分布。该特征来自 GO 和 KEGG 基因集数据库 (STAR 方法)。 *p < 0.001; Wilcox 检验。 (F) 癌组织、胰腺炎、胆囊炎和 COVID-19 样本中中性粒细胞亚群的比例。

以富集通路来表征细胞的功能/地位 ↩
单细胞数据探究中用于验证细胞类型分布和表达的湿实验类型：流式和免疫组化 ↩
由表型转向机制——从拟时序和湿实验两个方面验证独特的细胞分类在肿瘤中显著浸润，通过代谢通路富集转向代谢微环境对细胞类型变化的调控 ↩↩
在代谢微环境诱导产生特殊亚群后，即继续探讨其对免疫微环境的影响 ↩