Onco fetal Reprogramming of Endothelial Cells Drives Immunosuppressive Macrophages in Hepatocellular Carcinoma
引言¶
肝脏在人体生理中扮演着至关重要的角色，从早期胎儿造血的主要场所（Christensen 等，2004 年）到成人稳态时代谢脂肪、糖类和蛋白质等营养素的关键调节器（Rui，2014 年）。因此，肝功能障碍可能导致多种危及生命的状况，包括非酒精性脂肪肝炎（NASH）、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、肝硬化和肝细胞癌（HCC），这些疾病每年造成约 200 万人死亡（Williams 等，2014 年）。肝脏独特的极高再生潜力有助于克服急性损伤并维持肝胆系统的完整性。肝脏受伤及随后的炎症反应是再生的信号（Forbes 和 Newsome，2016 年）。然而，严重的肝损伤或再生潜力的丧失可能导致不可修复的损害。肝脏疾病主要由饮食（药物/酒精）或病毒（甲/乙/丙型肝炎）因素引起，导致脂肪肝、肝硬化，最终发展为癌症（Williams 等，2014 年）。
在这些疾病中，HCC 是全球癌症相关死亡的第二大常见原因（杨等，2019 年）。早期 HCC 可能通过手术切除或器官移植进行治疗，晚期疾病通过系统治疗；然而，治疗的整体复发率较高（Bruix 和 Sherman，2011 年）。肿瘤由多种细胞类型组成，免疫系统和转化细胞之间存在持续的“军备竞赛”（Tabassum 和 Polyak，2015 年）。这些相互作用导致肿瘤细胞被消除或成功定植。一个有利的肿瘤生态系统允许恶性细胞在营养缺乏和免疫选择压力下存活。值得注意的是，肿瘤的不同区域可能代表肿瘤生态系统中的异质性，构成不同的肿瘤、基质和免疫细胞类型（McGranahan 和 Swanton，2017 年；Smith 和 Hodges，2019 年）。这种区域内的肿瘤异质性（ITH）可能促进细胞 - 细胞相互作用的多样性。此外，肿瘤生态系统细胞如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、内皮细胞（ECs）和免疫细胞的异质性可能进一步影响临床上的治疗反应。然而，系统地研究定义 ITH 的转录组、空间和功能景观以及 HCC 生态系统中由此产生的独特细胞 - 细胞相互作用的研究仍然是一个难题。
肿瘤细胞已知表现出表型可塑性，这有助于细胞多样性和肿瘤进化（Cassetta 等，2019 年；Sharma 等，2018 年）。关于胚胎发育与肿瘤发生之间的相似性的文献证实了肿瘤细胞可以重编程和/或转分化为癌干细胞（CSCs）的观点（Clevers，2011 年）。此外，一些恶性细胞已知表达特定于胎儿发育的抗原，一个典型的例子是 HCC 中的甲胎蛋白（AFP）表达（Behne 和 Copur，2012 年）。这些研究将恶性细胞的表型特征与早期发育程序联系起来。然而，肿瘤生态系统再现早期发育特征的能力尚待研究。在本研究中，我们着手生成一个全面的人类肝脏图谱，包括胎儿发育、成人稳态和癌症。这为理解肝脏生物学及其在人类疾病中的影响提供了前所未有的机会。
在这里，我们全面分析了大约 212,000 个单细胞，包括人类胎儿肝脏（大约 60,000）、HCC（邻近正常大约 16,500；肿瘤大约 57,200）和小鼠模型（大约 79,000）。我们报告了来自胎儿、邻近正常和肿瘤组织的大约 30 个主要簇，代表人类肝脏中的多种细胞类型。通过系统地询问转录组配置文件、细胞相互作用、基因调控网络和空间转录组学，我们呈现了肝脏发展和癌症的比较分析。这导致识别了 HCC 中一种新的免疫抑制“胚胎 - 肿瘤生态系统”，包括胎儿肝和 HCC 中共有的基质和免疫细胞类型以及信号组分。此外，我们采用了一种最先进的遗传谱系追踪小鼠模型来确定 HCC 中各种 TAM 亚群的发生。我们的体外细胞 - 细胞相互作用和空间转录组学分析进一步提供了有关促进肿瘤生态系统免疫抑制胚胎 - 肿瘤重编程的细胞通信的洞见。综合考虑，我们的工作为通过 VEGF/NOTCH 信号在 HCC 中的免疫抑制胚胎 - 肿瘤肿瘤微环境（TME）提供了一个新的范式。
结果¶
多部门单细胞 HCC 图谱¶
为了理解肿瘤生态系统的复杂性以及恶性细胞、基质细胞和免疫细胞在 HCC 中的动态相互作用，我们采用了基于滴定的单细胞转录组学方法（10× chromium）。HCC 主要由病毒或代谢因素驱动（Villanueva，2019 年）；我们的研究包括了阳性（慢性乙型肝炎）和阴性肿瘤。此外，为了生成一个全面的空间 ITH 单细胞 RNA（scRNA）测序（scRNA-seq）图谱，我们从多个部门的外科切除的 HCC 肿瘤组织中采样，这些组织有明显划分的核心和外围区域（Zhai 等，2017 年）。作为参考，我们同时描述了邻近“正常”组织以及从肝脏移植捐赠者获得的一个“健康正常”组织。由于大多数组织解离协议不利于非免疫细胞的恢复（Aizarani 等，2019 年；MacParland 等，2018 年），我们通过磁性分选 CD45+ 和 CD45- 细胞，然后进行 1:1 混合，之后生成单细胞滴定（图 1A）。首先，我们分析了来自 14 位 HCC 患者（5 位 HepB- 和 9 位 HepB+）以及一位健康捐赠者的 57 个部门，共约 74,000 个细胞（每个细胞约 2,600 个基因）（图 1A-1F，S1A 和 S1B；表 S1）。Louvain 聚类将这些细胞识别为代表上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞群体的 29 个不同主要簇（图 1B 和 1F）。接下来，我们使用特异性标志物来注释 Louvain 簇为肝脏的主要细胞类型，包括 B 细胞（MZB1；CD79A）、T 细胞（CD3E；IL7R；CD8）、NK（自然杀伤；GNLY；NKG7）、髓样（LYZ；CD14）、成纤维细胞（ACTA2；THY1）、内皮细胞（PECAM1；冯维尔勃朗德因子 [VWF]）和肝细胞（ALB+；KRT8+）（图 1B）。总的来说，我们识别了成纤维细胞（簇 13）、多能祖细胞（簇 24）、B 细胞（簇 18）、肥大细胞（簇 28）和调节性 T 细胞（簇 12）各 1 个簇；CD8+ 细胞毒性 T 细胞 2 个簇（簇 3，4）；CD4+ 辅助 T 细胞和髓样细胞各 3 个簇（簇 0，5，23 和簇 8，10，19）；NK/NKT 细胞 4 个簇（簇 1，9，15，22）；内皮细胞 5 个簇（簇 2，6，17，26，27）；以及肝细胞 7 个簇（簇 7，11，14，16，20，21，25）（图 1B；表 S2）。
图 1A 多部门单细胞 HCC 图谱
（A）多部门 scRNA-seq 肝细胞癌（HCC）肿瘤（来自乙型肝炎阳性和阴性肿瘤）。
（B）Louvain 聚类约 74,000 个来自 14 名 HCC 患者和一名健康捐赠者的 scRNA-seq 文库，识别出肝脏中的 29 个巨型簇。
（C）根据细胞在邻近正常（黄色）、肿瘤核心（红色）和外围（紫色）的空间分布对 Louvain 簇进行着色。饼图显示髓样、内皮和淋巴簇及其在肿瘤外围、核心和邻近正常区域的分布。
（D）UMAP 根据个体受试者 ID 进行着色；条形图表示每个个体的细胞数量。
（E）UMAP 根据病毒状态着色，Hep-B+（蓝色）和 Hep-B-（红色）。
（F）表达与免疫、基质和上皮细胞类型相关的基因。
（G）点图描述了 HCC 图谱中的特定细胞类型标记。
（H）热图比较了手工注释的细胞类型与基于 Garnett 的、不依赖簇的细胞类型注释。
另见图 S1 和 S2 及表 S1、S2 和 S3。
图 S1A 多部门单细胞 HCC 图谱，与图 1 相关
（A）UMAP 按照各部门 ID 进行着色，
（B）条形图表示每个部门的细胞数量（HN- 健康正常；P- 患者），
（C）比例条形图表示病毒阳性与病毒阴性患者中簇频率。卡方检验分数：1000.85；自由度：28；p 值：9.48789 e -193
表示以下内容的比例条形图：
（D）内皮细胞群（簇 2, 6, 17, 26, 27）。卡方检验分数：257.022；自由度：8；p 值：5.58796 e -51
（E）髓样细胞群（簇 8, 10）。卡方检验分数：58.8732；自由度：2；p 值：1.6438 e -13
（F）免疫细胞群（簇 0, 1, 3, 4, 5, 9, 12, 15, 22, 23）在外围肿瘤、核心和邻近正常组织中的频率。卡方检验分数：344.648；自由度：18；p 值：2.92735 e -62
（G）点对点图分析显示各簇中的细胞频率。每个簇中的细胞数根据每个患者样本中分析的邻近正常和肿瘤的细胞数进行了标准化。颜色表示每位患者中肿瘤与正常比较的富集分数。
（H）作为箱线图表示的四个主要簇（内皮 -2，TAM，调节性 T 细胞和 PLVAP+ ECs）的成对分析
（I）肝图谱标记质量图，x 轴代表模糊度得分，颜色对应于给定细胞类型的指定细胞百分比。
我们观察到某些细胞类型在肿瘤和邻近正常组织中具有特异性聚集，这表明在肝细胞癌（HCC）中可能对肿瘤微环境（TME）进行了重塑。我们还在肿瘤核心、外围及邻近正常组织中发现了独特的内皮细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞（图 1C）。特别地，我们发现与胎儿肝脏相关的 PLVAP+ 内皮细胞（Rantakari 等人，2016 年）、CD163+ 巨噬细胞和 TIGIT+ 调节性 T 细胞在肿瘤组织中特别丰富，而细胞毒性 CD8+ T 细胞和 NKT 细胞主要存在于邻近正常组织中（图 1C 和 S1D–S1H）。与张等人（2019 年）的发现一致，我们也观察到病毒阳性和阴性肿瘤中没有任何特定的免疫细胞群体，表明两种类型的 HCCs 都呈现出“肿瘤表型”的趋同（图 1E 和 S1C）。基于顶级差异表达基因，我们为 29 个主要簇各自识别了独特标记物（图 1G；表 S3），并使用机器学习算法“Garnett”（Pliner 等人，2019 年）为每个簇分配特征标记。这使我们能够开发出一种不依赖簇的细胞类型注释方法（图 1H 和 S1I）。总体而言，我们对人类肝脏正常和肿瘤组织中约 74,000 个单细胞的全面分析提供了一个前所未有的机会，可以将此图谱与其他肝脏数据集进行比较（Aizarani 等人，2019 年；MacParland 等人，2018 年；Ramachandran 等人，2019 年；张等人，2019 年）。
HCC 单个细胞类型的亚聚类¶
由于我们观察到正常和肿瘤生态系统之间有显著的差异，我们开始进一步识别疾病特异性细胞类型。我们将主要簇细分为 T 细胞、NK/NKT 细胞、B 细胞、髓样细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肝细胞，随后重新对这些细胞类型进行聚类。T 细胞的亚聚类识别出 20 个簇（图 S2A）。有趣的是，虽然肿瘤中明显富集了天真和调节性 CD4+ 细胞，但它们明显缺乏细胞毒性 CD8+ 细胞，这是“非炎症性”或“冷”（Lambrechts 等人，2018 年）肿瘤的经典标志（图 S2A）。我们进一步分析了每个簇中各个患者样本的频率，并随后识别了簇特异性标记物（图 S2B 和 S2C）。NK 细胞的亚聚类识别出 10 个簇，将 NK 细胞分为 CD56Bright、KLRC2+（适应性）和 KLRC1+（教育性）群体（图 S2D–S2I）。此外，我们还识别了一个 NKT 细胞簇。CD56Bright NK 和 NKT 细胞在邻近正常组织中特别丰富，而肿瘤浸润的 NK 细胞表达与记忆型 NK 细胞相关的 KLRC1 和 KLRC2 标记（Ram 等人，2018 年）（图 S2E 和 S2F）。引人入胜地，我们发现了以前未知的 KRT81、KRT86 和 MYOM2 阳性 NK 细胞群体（图 S2E–S2I）。有必要进行进一步的研究，以了解这些新 NK 细胞群体在肝脏中的功能。
图 S2 关于图 1 的淋巴细胞、成纤维细胞和肝细胞的亚聚类
（A）T 细胞从 UMAP（图 1B）进行亚聚类，随后通过对 14 名 HCC 患者和一名健康捐赠者的约 34,000 个单细胞 RNA-seq 文库进行 Louvain 聚类，识别出肝脏中的 20 个簇。UMAP 按个体患者/受试者 ID（如图 1D）进行着色。细胞在邻近正常（黄色）、肿瘤核心（红色）和外围（紫色）区域的空间分布。
（B）条形图表示单个患者中的细胞类型频率，邻近正常与肿瘤以及每个 Louvain 簇。
（C）点图表示 T 细胞群体中的簇特异性标记。
（D）NK 细胞从 UMAP（图 1B）进行亚聚类，随后通过对 14 名 HCC 患者和一名健康捐赠者的约 5,000 个单细胞 RNA-seq 文库进行 Louvain 聚类，识别出肝脏中的 10 个簇。UMAP 按个体患者/受试者 ID（如图 1D）进行着色。细胞在邻近正常（黄色）、肿瘤核心（红色）和外围（紫色）区域的空间分布。
（E）UMAP 中 FCGR3A、MYOM2、KRT86、NCAM1（CD56）、KLRC1、KLRC2、S100B、KRT81 和 KIR2DL1 的表达。
（F）点图表示 NK 细胞群体中的簇特异性标记。
条形图表示（G）单个患者中的细胞类型频率，
（H）邻近正常与肿瘤以及
（I）每个 Louvain 簇。
（J）成纤维细胞从 UMAP（图 1B）进行亚聚类，随后通过对 14 名 HCC 患者和一名健康捐赠者的约 1,900 个单细胞 RNA-seq 文库进行 Louvain 聚类，识别出肝脏中的 9 个簇。UMAP 按个体患者/受试者 ID（如图 1D）进行着色。细胞在邻近正常（黄色）、肿瘤核心（红色）和外围（紫色）区域的空间分布。
（K）UMAP 中 TAGLN、ACTA2、MYH11、JAG1、THY1、LUM、MT1A 和 CDH19 的表达。
（L）点图表示成纤维细胞群体中的簇特异性标记。
（M）条形图表示单个患者中的细胞类型频率，邻近正常与肿瘤以及每个 Louvain 簇。
（N）肝细胞从 UMAP（图 1B）进行亚聚类，随后通过对 14 名 HCC 患者和一名健康捐赠者的约 13,000 个单细胞 RNA-seq 文库进行 Louvain 聚类，识别出肝脏中的 13 个簇。UMAP 按个体患者/受试者 ID（如图 1D）进行着色。细胞在邻近正常（黄色）、肿瘤核心（红色）和外围（紫色）区域的空间分布。
（O）UMAP 中 ALB、MALAT1、NEAT1、SPINK1、MLXIPL、KRT8、KRT19、S100A10、HGF、SOX4、FXYD1 和 CYP2E1 的表达。
（P）点图表示肝细胞群体中的簇特异性标记。
（Q）条形图表示单个患者中的细胞类型频率，邻近正常与肿瘤以及每个 Louvain 簇。
成纤维细胞的亚聚类识别出 9 个簇，清晰地划分了正常成纤维细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）。在 HCC 中，CAFs 表达 MYH11、ACTA2、THY1 和 TAGLN 这些通常与活化成纤维细胞相关的标记物（图 S2J-S2M）。上皮细胞的聚类识别出 13 个肝细胞（ALB+）簇和一个双潜能（KRT8+/KRT19+）簇（图 S2N）。有趣的是，双潜能细胞特定于正常组织，并且在所有个体中都存在（图 S2N-S2Q）。与最近发表的头颈部（Puram 等，2017）、肺部（Lambrechts 等，2018）和胶质母细胞瘤（Neftel 等，2019）肿瘤细胞图谱一致，我们也观察到肿瘤细胞的患者特异性聚类，这突出显示了患者特异性驱动和乘客突变对肝上皮细胞转录组的主导影响（图 1D）。尽管如此，来自多个患者的肝细胞可以大致聚类为四个主要群体：SOX4+、SPINK1+、MALAT1+ 和 MALAT1+/NEAT1+ 细胞（图 S2O-S2Q）。这些亚群体存在于多于一个患者中，表明肿瘤上皮中的共享分子特征。
识别肿瘤相关的内皮和巨噬细胞群体¶
从单细胞肝脏图谱得到的主要簇中，两种在肿瘤和邻近正常组织中明显不同的细胞类型是内皮细胞（ECs）和巨噬细胞。因此，我们通过亚聚类重新分析了 ECs 和髓样亚群体。共 11,672 个 ECs 形成了 11 个簇（图 2A），除了 TFF3+ 的淋巴内皮细胞外，所有其他细胞类型都特定于正常或肿瘤组织（图 2B 和 S3A-S3C）。特别地，PLPP3+、IGFBP3+ 和 PLVAP+ ECs 在肿瘤组织中富集。其中，质膜囊泡相关蛋白（PLVAP）已知在肝脏发展和疾病中发挥重要作用（Ramachandran 等，2019；Rantakari 等，2016）。有趣的是，基于 VEGFR2、NRP1（簇 3）、ACKR1（簇 9）和 HLA-DR（簇 4）的表达，我们观察到三个 HCC 特异性的 PLVAP+ ECs 簇（图 2C）。此外，为了确定肿瘤特异性 PLVAP+ ECs 的可能起源，我们进行了 RNA 速度分析（La Manno 等，2018）。RNA 速度预测肿瘤特异性 PLVAP+ ECs 可能起源于一个中间 ECs 亚群（图 2D）。有趣的是，簇 -3 相关基因显示出快速（PLVAP 和 NRP1）和慢速（VEGFR2）的 RNA 速度，这表明这些细胞处于动态转录状态（图 2E）。
图 2 HCC 中的肿瘤特异性基质和免疫细胞类型
（A）对来自 HCC 肿瘤和邻近正常区域的 11,672 个内皮细胞进行 Louvain 聚类，识别出 11 个簇。
（B）邻近正常、肿瘤（核心和外围）区域内皮 Louvain 簇的空间组织。
（C）在 Louvain 簇中表达 PLVAP、HLA-DRA、ACKR1、VEGFR2 和 NRP1。
（D）EC 簇的稳态 RNA 速度，箭头表示细胞状态转换的方向性。
（E）肿瘤特异性 EC 基因 PLVAP、VEGFR2 和 NRP1 的 RNA 速度。
（F）对 8,102 个髓样细胞进行 Louvain 聚类，揭示了单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞簇，包括三个肿瘤相关巨噬细胞簇、两个 DC2 簇、一个 cDC1、一个 pDC 和一个单核细胞亚群。
（G）邻近正常、肿瘤（核心和外围）区域髓样 Louvain 簇的空间组织；圆圈图显示每个 Louvain 簇中的部门比例。
（H）维恩图表示 TAM 亚群中的差异基因。
（I）在 UMAP 中表达 TAM1（CD163 和 FOLR2）、TAM2（SPP1）和 TAM3（MT1G）特异性基因。
（J）髓样簇的稳态 RNA 速度。
（K）TAM1 标记 FOLR2 和 HES1 的 RNA 速度。
（L）TAM1 和 TAM2 标记的点图。
另见图 S3 和表 S4。
图 S3 肿瘤相关的内皮和髓样细胞，与图 2 和图 3 相关
（A）内皮细胞从 UMAP（图 1B）进行亚聚类，随后对来自 14 名 HCC 患者和一名健康捐赠者的单细胞 RNA-seq 文库进行 Louvain 聚类，识别出肝脏中的 11 个簇。UMAP 按个体患者/受试者 ID（如图 1D）进行着色。
（B）点图表示内皮细胞群体中的簇特异性标记。
（C）条形图表示单个患者、邻近正常与肿瘤以及每个 Louvain 簇中的细胞类型频率。
（D）单核吞噬细胞（MNPs）从 UMAP（图 1B）进行亚聚类，随后对来自 14 名 HCC 患者和一名健康捐赠者的单细胞 RNA-seq 文库进行 Louvain 聚类，识别出肝脏中的 9 个簇。UMAP 按个体患者/受试者 ID（如图 1D）进行着色。
（E）点图表示 MNP 群体中的簇特异性标记。
（F）条形图表示单个患者、邻近正常与肿瘤以及每个 Louvain 簇中的细胞类型频率。
（G）通过流式细胞术分析的所有 CD45+ 细胞的 UMAP 分析。密度图显示了选定标记的相对表达和界定单核吞噬细胞（MNP）的门控。重新通过 UMAP 分析在图 S3G 中定义的 MNP 的密度图显示。意义图显示了在 MNP UMAP 空间中选定标记的相对表达。
（H）HCC 和邻近正常组织中 MNPs 的多参数流式细胞仪分析。基于 CD163 和 CD206 标记的表达鉴定 TAM1 和 TAM2/3 亚群。
（I）肿瘤和邻近正常组织中 TAM1（FOLR2 为绿色，CD163 为红色）和 TAM2（SPP1 为白色）的空间定位。
（J）通过 RNA-FISH 检测邻近正常和肿瘤组织中的 PLVAP+ ECs（白色）和 ALB+ 肝细胞（绿色）的表达。
（K）邻近正常和肿瘤组织中 TAM1 和 TAM2 群体的定量数据（平均值 ± 标准误差，n = 3，*p < 0.05）。
（L）邻近正常和肿瘤组织中 PLVAP+ ECs 和 ALB+ 肝细胞群体的定量数据（平均值 ± 标准误差，n = 3，**p < 0.001，p < 0.05）
（M）点图描绘了胎儿和 HCC 图谱中簇特异性标记。
（N）维恩图显示 FLM、TAM1 和 TAM2 之间的重叠。
单核吞噬细胞（MNPs）的亚聚类分析识别出两种单核细胞、三种树突状细胞（DC1、DC2 和 pDCs）（Dutertre 等，2019 年），以及四种巨噬细胞簇（图 2F；表 S4）。巨噬细胞群体主要存在于肿瘤中，而 DCs 和单核细胞则在正常组织中富集（图 2G 和 S3D-S3F）。巨噬细胞相关的清道夫受体 CD163 的表达进一步将肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）细分为 CD163 高表达的 TAM1 和 CD163 低表达的 TAM2/TAM3 亚群（图 2H 和 S3E）。差异基因表达分析识别出 TAM 亚群的独特标记物，即表达叶酸受体 β（FOLR2）的 TAM1，骨桥蛋白（SPP1）阳性的 TAM2，以及富含金属硫蛋白 1G（MT1G）的 TAM3（图 2H 和 2I）。由于 TAMs 可以由单核细胞衍生或为组织驻留细胞，因此利用 RNA 速度分析来探索 HCC 巨噬细胞群体的谱系轨迹。我们的分析揭示，两个 FOLR2+ 的 TAM1 群体（簇 1 和 7）可能有不同的起源（图 2J）。RNA 速度分析还表明，FOLR2+ 的 TAM1 簇之一可能由单核细胞衍生（簇 7），而另一个似乎为胚胎起源的组织驻留巨噬细胞（TRMs）（簇 1）（图 2J）。有趣的是，衍生自单核细胞的 FOLR2+ 簇与组织驻留的 FOLR2+ 簇相比，表达了更高水平的 HES1，这暗示 Notch 信号可能在 TAM1 亚群的出现中发挥作用（图 2K 和 2L）。这些结果表明，在 HCC 中，一群衍生自单核细胞的巨噬细胞可能被重编程以获得类胚胎表型。
接下来，我们采用流式细胞术来验证基于蛋白标记的 TAM 亚群。与 scRNA-seq 数据一致，我们在 HCC 中检测到 CD163 高/CD206 高的 TAM1 和 CD163 低/CD206 低的 TAM2/TAM3 亚群的富集（图 S3G 和 S3H）。我们还对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行了 RNA 荧光原位杂交（RNA-FISH）以进一步验证 FOLR2 和 SPP1 在不同巨噬细胞群体中的表达。除了验证 scRNA-seq 和荧光活细胞分选（FACS）数据外，我们还观察到肿瘤组织中 CD163+/FOLR2+（TAM1）和 CD163-/SPP1+（TAM2）亚群的空间定位（图 S3I 和 S3K）。因此，我们全面的 scRNA-seq 分析结合 FACS 和 FISH 验证，提供了 HCC 中巨噬细胞异质性的独特见解。这也确立了 FOLR2 和 SPP1 作为 HCC 中 TAM1 和 TAM2 亚群的独特标记物。类似地，我们采用 RNA-FISH 检测正常和肿瘤 ECs 中的 PLVAP 表达，并观察到 PLVAP 表达实际上特定于肿瘤组织（图 S3J 和 S3L）。这些结果印证了来自 scRNA-seq 图谱的观察，并为内皮细胞和巨噬细胞群体确立了特定标记物，表明 HCC 中存在与胎儿相关的 PLVAP+ EC 和类胚胎的 FOLR2+ TAM1。
肿瘤特异的 PLVAP+ ECs 和 FOLR2+ 巨噬细胞在人类胎儿肝脏中¶
已知肿瘤细胞能够重现早期胎儿发展的特征，包括获得干细胞样特征、上皮 - 间充质转化（EMT）和表达肿瘤胎儿蛋白（Yong 等，2013）。然而，肿瘤生态系统的类胎儿重编程尚待研究。我们数据中最引人注目的观察之一是肿瘤组织中 PLVAP+/NRP1+/VEGFR2+ ECs 的富集。偶然的是，最近的一份报告描述了 PLVAP+/NRP1+ ECs 在小鼠胎儿肝脏发展中播种 TRMs 的关键功能（Rantakari 等，2016）。因此，我们假设肿瘤中 PLVAP+ ECs 的存在也可能促进 TME 中类胎儿巨噬细胞的出现，从而协调 TME 的肿瘤胎儿重编程。为了研究这一点，我们对人类胎儿肝脏组织进行了 scRNA-seq，这些组织的估计妊娠年龄（EGA）为 16 周和 21 周，并将这些数据集（通过使用 CellRanger 算法的 cell aggr 函数）与 HCC scRNA-seq 数据聚合。共分析了约 105,000 个来自人类胎儿肝脏和 HCC 的单细胞（图 3A 和 S3M），聚合的单细胞图谱显示胎儿和肿瘤的内皮细胞以及髓样细胞之间的显著相似性（图 3B）。ECs 的分析形成了 10 个簇，其中 3 个特定于胎儿内皮，表明胎儿 ECs 在早期发展中的独特角色。重要的是，我们发现 PLVAP+ ECs 主要在胎儿和肿瘤组织中富集，而在正常稳态中相对缺失。最重要的是，这些结果进一步印证了 HCC 中 PLVAP+ ECs 可能发生类胎儿重编程的可能性（图 3C-3E）。
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图 3 HCC 中内皮和髓样细胞的肿瘤 - 胎儿重编程
（A）通过 Cell Ranger 算法的 cell aggr 函数聚合的 105,000 个单细胞，来自发育中的胎儿肝脏（妊娠 16 和 21 周）、健康正常肝脏、肿瘤及 HCC 邻近正常区域，识别出 31 个巨型簇。
（B）UMAP 按个体受试者 ID 进行着色，并展示与上皮（ALB 和 KRT19）、基质（PLVAP 和 ACTA2）和免疫（IL7R、CD8A、GNLY、MZB1 和 CD14）细胞类型特异性标记基因相关的表达。
（C）内皮细胞的 Louvain 亚聚类识别出 10 种细胞类型，包括肿瘤特异性的 PLVAP+/HLA–DRA+ ECs、SLC9A3R2+ 正常 ECs 和 CLEC1B+ 胎儿 ECs。
（D）按样本来源（胎儿、邻近正常和肿瘤）着色的 ECs UMAP。
（E）UMAP 中内皮标记物 PLVAP、HLA-DRA、CD320、IGFBP3、PLPP3 和 TFF3 的表达。
（F）胎儿、正常和肿瘤 MNP 细胞的整合亚聚类识别出 14 个簇，包括三种 TAM、胎儿肝巨噬细胞（FLMs）、胎儿和成人特异性单核细胞以及 DCs。
（G）按样本来源（胎儿、邻近正常和肿瘤）着色的 MNPs UMAP。
（H）细胞特异性标记物 S100A8（单核细胞）、FOLR2（TAM1 和 FLM）和 SPP1（TAM2）的表达。小提琴图显示 FLMs 和 TAM1 中 CD163 和 FOLR2 的高表达，而 TAM2 中 SPP1 的高表达。
（I）胎儿、邻近正常和肿瘤 MNPs 的多参数流式细胞术分析。UMAP 按样本来源以及 CD14、CD16、CD206、CD163 和 FOLR2 的表达进行着色。
（J）不同肿瘤和邻近正常区域中单核细胞、TAM2/3 和 TAM1 群体中 FOLR2 MFI（中位荧光强度）的量化。
（K）来自四名不同 HCC 患者（肿瘤和邻近正常）及胎儿肝脏组织的单核细胞、TAM2/3 和 TAM1 群体中 FOLR2 MFI 的量化。
另见图 S3 和 S4。
对单核吞噬细胞（MNPs）的分析也揭示了类似的显著见解。我们在聚合的胎儿和 HCC 数据集中识别出 14 个簇，包括五个主要与胎儿相关的细胞簇、共同髓系祖细胞（CMPs）、巨核细胞、单核细胞、DCs 和巨噬细胞群体（图 3F）。有趣的是，我们观察到 HCC 和胎儿组织的细胞在巨噬细胞、DC 和单核细胞簇中的交错。最令人惊讶的观察是胎儿肝巨噬细胞（FLM，簇 6）和 TAM1 亚群之间的意外相似性。FLM 和 TAM1 群体都表现出独特的 FOLR2 高/CD163 高基因表达特征，这一特征明显不同于 TAM2（SPP1+）和 TAM3（MT1G+）亚群（图 3G、3H 和 S3N）。接下来，我们通过流式细胞术验证了这些观察结果，证明 FLM 确实表现出 FOLR2 高/CD163 高的 TAM1 样表型（图 3I，S4A 和 S4B）。重要的是，我们检测到在 FLM 和 TAM1 中 FOLR2 高巨噬细胞群体相比邻近正常肝脏有显著富集（图 3J 和 3K）。总之，这些结果表明与胎儿肝脏相关的 FOLR2+ 巨噬细胞在 HCC 中具有特定的富集。
图 S4 HCC TAM1 和 PLVAP+ ECs 的类胎儿重编程，与图 3 和图 4 相关
（A）在人类胎儿肝脏和 HCC 巨噬细胞中 FOLR2、CD163 和 CD206 的表达。
（B）定义单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）的手动门控策略展示。每个群体在门控策略的所有祖系门控内进行回溯门控。
（C）用于分析小鼠（8 周龄）肝巨噬细胞的门控策略。在 CD45+ Lin- CD11b+ CD64+ F4/80+ Tim4+ 的 Kupffer 细胞中，绝大多数（约 97%）来自胎儿肝脏，在 Ms4a3Cre-RosaTdT 模型中未被标记，而少部分 Tomato+ 来自成年单核细胞。
（D）控制小鼠数据的 UMAP Louvain 聚类约 17,000 个细胞，随后按样本 ID 着色的 UMAP 和 FOLR2 表达图。
（E）Seurat 整合的约 134,500 个来自四个胎儿肝脏和十四个 HCC 样本的细胞的 UMAP，导致 39 个簇。
（F）簇特异性标记的点图。
（G）按胎儿年龄、邻近正常和肿瘤组织着色的 UMAP。
（H）PLVAP 的表达，注意胎儿和肿瘤细胞的整合。
（I）FOLR2 的表达，注意胎儿和肿瘤细胞的整合。
（J）比例条形图表示邻近正常、肿瘤和胎儿细胞中 CD45+ 和 CD45- 群体的分布。
跨物种比较分析小鼠胚胎期植入、人体胎肝和肿瘤巨噬细胞¶
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在人体癌症中的起源仍然是一个未被探索的领域。这部分是由于缺乏可靠的标志物来区分组织驻留巨噬细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞，更主要的是缺乏精确的工具。最近，我们生成了 Ms4a3Cre-RosaTdT 命运示踪报告小鼠（Liu 等，2019），这使我们能够区分胚胎期植入的（Tomato–）和单核细胞衍生的巨噬细胞（Tomato+）。为了探讨部分肝细胞癌（HCC）TAMs 是否经历了类似胎儿的重编程，我们对来自 Ms4a3Cre-RosaTdT 小鼠的约 17,000 个肝细胞（包括 Tomato–，Tomato+，和 CD45–细胞）进行了单细胞 RNA 测序（图 S4C 和 S4D）。接下来，我们使用基于机器学习的算法 Garnett（Pliner 等，2019）对小鼠胚胎期植入的巨噬细胞、人体胎肝和肿瘤巨噬细胞进行了跨物种比较分析。首先，我们基于 HCC 中的 MNPs 标志物训练了“Garnett 分类器”，然后在 Ms4a3Cre-RosaTdT 小鼠和人体胎肝中进行测试（图 4A）。其次，我们调查了这种机器学习分析能否在人体胎肝和小鼠肝脏数据集中识别出相似的细胞类型（图 4B）。作为原理验证，该机器能够以非常高的相关性预测出 HCC 中的所有细胞类型（图 4C）。该机器还检测到 HCC 和人体胎肝及小鼠肝脏中单核细胞和树突状细胞之间的相似性（图 4D 和 4E）。令人惊讶的是，该机器检测到 HCC-TAM1、人体胎肝巨噬细胞和小鼠胚胎期植入的肝巨噬细胞之间的基因表达非常相似（图 4C 和 4E）。
图 4 跨物种和发育阶段的转录组比较分析
(A) 基于 Garnett 的机器学习 HCC 髓系细胞分类器示意图。 (B) 机器学习过程的表示；HCC 髓系数据用作训练数据集。胎肝和 HCC 合并髓系或 Ms4a3Cre-RosaTdT 数据集用作测试数据集。 (C) 比较 HCC 训练和 HCC 测试的相关性热图。 (D) 比较 HCC 训练和胎肝与 HCC 合并数据集的相关性热图。 (E) 比较 HCC 训练和小鼠数据集的相关性热图。注意 TAM1 和小鼠胚胎期植入（Tomato 阴性）巨噬细胞之间的高相关性。 (F) 使用 Seurat 算法的整合功能对胎肝、邻近正常和肿瘤组织中的髓系细胞进行整合。Louvin 聚类将髓系细胞分为 12 个簇。 (G) UMAP 按细胞来源着色，即胎肝（紫色）、邻近正常（黄色）和肿瘤（红色）。 (H) TAM1 标志物 FOLR2 在簇 1 和 TAM2 标志物 SPP1 在簇 7 中的表达。 (I) 每个簇中胎肝（紫色）、邻近正常（黄色）和肿瘤（红色）细胞的比例。 (J) 对胎肝、邻近正常和肿瘤组织中的内皮细胞（ECs）进行整合。Louvin 聚类将髓系细胞分为 13 个簇。 (K) UMAP 按细胞来源着色，即胎肝（紫色）、邻近正常（黄色）和肿瘤（红色）。 (L) HCC 胎儿样内皮细胞标志物 PLVAP 和 VEGFR2 在簇 5 中的表达。 (M) 每个簇中胎肝（紫色）、邻近正常（黄色）和肿瘤（红色）细胞的比例。
另见图 S4 和表 S4。
为了独立确认这些结果，我们对另外两个人体胎肝组织（14 周和 18 周 EGA）进行了分析，并使用 Seurat 整合（Stuart 等，2019）编制了来自 14 个 HCC 和 4 个胎肝组织的单细胞 RNA 测序文库（图 S4E）。共分析和注释了约 134,500 个单细胞文库中的不同细胞类型（图 S4F-S4J）。接下来，我们对整合的髓系细胞数据集进行了子聚类，结果形成了 12 个簇，代表了树突状细胞（DCs）、单核细胞和巨噬细胞（图 4F）。有趣的是，整合后，FOLR2+ TAM1 和一部分胎肝巨噬细胞（FLMs）聚集在一起，形成了簇 1（图 4G-4I）。这也表明，在聚合数据集中观察到的独立 FOLR2+ TAM1 簇（图 2F 和 3F）代表了不同的细胞状态（TAM1），在整合过程中合并了。重要的是，SPP1+ TAM2 形成了一个独立的簇，与 FLMs 没有任何混合。这些结果清楚地表明，HCC 中的 FOLR2+ TAM1（类胎儿 TAM 或 F-TAMs）与胚胎期植入的巨噬细胞表现出显著的相似性，表明 HCC 中 TAMs 的类胎儿重编程。
VEGF 信号在 PLVAP+ 内皮细胞（ECs）中的作用¶
接下来，为了确定胎肝和 HCC PLVAP+ ECs 之间的相似性，我们将整合的内皮细胞数据集进行子聚类，形成了 13 个簇，识别出邻近正常、肿瘤和胎儿特异性的内皮细胞（图 4J-4L）。重要的是，我们观察到胎儿和肿瘤内皮细胞在 PLVAP+ 簇 1 和 5 中的整合（图 4M）。由于已知 VEGF 信号在血管生成中起重要作用，我们调查了肿瘤和内皮细胞之间的细胞间相互作用。我们进行了 NicheNet（Browaeys 等，2019）分析，该分析允许我们通过链接配体和靶基因表达来预测细胞间相互作用。有趣的是，NicheNet 预测肝细胞来源的 VEGFA 可以在肿瘤内皮细胞中激活 PLVAP（图 5A）。值得注意的是，大部分 PLVAP+ ECs 表达 VEGF 受体（图 2C 和 4L），因此强烈暗示肿瘤肝细胞和内皮细胞之间的通信导致了 PLVAP 的表达。重要的是，肝细胞介导的 VEGF 信号在胎肝器官发生（Carpenter 等，2005）以及 HCC 中的血管生成（Horwitz 等，2014）中调节内皮细胞孔径。此外，还已知细胞分裂会诱导肝细胞分泌 VEGF（Shimizu 等，2001），这是 PLVAP 表达的直接调节因子（Kim 等，2020；Strickland 等，2005）。我们通过 RNA-FISH 实验验证了这些观察结果，发现与邻近正常组织相比，HCC 中 VEGFA、PLVAP、ALB 和 CD163 的表达增加（图 5B 和 S5A）。同样，我们在 scRNA-seq 数据中观察到同一肿瘤区段中 VEGFA、VEGFR2 和 PLVAP 的更高相关性（图 S5C）。综合这些结果表明，VEGF 信号在胎肝和 HCC 中 PLVAP+ 内皮细胞的出现以及可能促进肿瘤微环境（TME）的类胎儿重编程中具有重要作用。
图 5 细胞间相互作用分析
(A) 肿瘤肝细胞和内皮细胞之间的 NicheNet 相互作用热图。注意在肿瘤内皮细胞中 VEGFA 特异性诱导 PLVAP 的表达。 (B) 四重 RNA-FISH，用于定位 ALB（绿色）、PLVAP（白色）、CD163（红色）和 VEGFA（洋红色）。 (C) 来自正常和肿瘤单细胞肝脏图谱的上皮、基质和免疫细胞之间的细胞相互作用弦图。 (D) 正常和肿瘤样本中髓系和淋巴细胞之间相互作用的点图。每一行代表一个配体 - 受体对，每一列定义一个细胞 - 细胞相互作用对。 (E) HCC 特异性配体 - 受体对的柱状图。 (F) HCC 特异性 TAM 和淋巴细胞之间配体 - 受体相互作用的点图。注意 TAM-CD4+、TAM-CD8+ 和 TAM-NK 细胞之间的免疫抑制相互作用。 (G) FOLR2+ TAM1 或 TAM2 与 CD4+ Tregs 相互作用的点图。 (H) TAM1 和 TAM2 亚群中 CXCL12、CXCL16、CD86、FOLR2、CD163 和 SPP1 的表达（Welch 独立 t 检验，*p < 0.0001，p < 0.001，*p < 0.01，p < 0.05）。
(I) 四重 RNA-FISH，用于定位相邻正常和肿瘤组织中的 ALB（绿色）、PLVAP（白色）、CD163（红色）和 TIGIT（洋红色）。 (J) 正常和肿瘤组织中 FOLR2（绿色）、SPP1（白色）、CD163（红色）和 TIGIT（洋红色）。箭头显示荧光图像中特定的细胞类型。注意 TAM1（FOLR2+ 和 CD163+）与 PLVAP+ 内皮细胞和 TIGIT+ 免疫细胞的共定位。
另见图 S5 和图 S6。
图 S5 RNA-FISH 图像和定量数据，相关于图 5
(A) 邻近正常和肿瘤中 PLVAP+ 内皮细胞、VEGFA+ 肝细胞和 CD163+ 巨噬细胞的定量数据。 (B) ALB+ 肝细胞（绿色）、PLVAP+ 内皮细胞（白色）、CD163+ 巨噬细胞（红色）和 TIGIT+ 调节性 T 细胞（洋红色）的单通道图像。 (C) 相关性热图，显示肿瘤和邻近正常区段中 VEGFA 信号成分与 PLVAP 表达之间的关系。注意肿瘤区段中强烈的 VEGFA & VEGFR2 和 VEGFA-VEGFR2 & PLVAP 表达，但在邻近正常区段中没有。 (D) 邻近正常和肿瘤中 PLVAP+ 内皮细胞、CD163+ 巨噬细胞和 TIGIT+ 调节性 T 细胞的定量数据。 (E) 肿瘤中低 PLVAP 和高 PLVAP 区域附近 CD163+ 巨噬细胞和 TIGIT+ 调节性 T 细胞的定量数据。 (F) FOLR2+ 巨噬细胞（绿色）、SPP1+ 巨噬细胞（白色）、CD163+ 巨噬细胞（红色）和 TIGIT+ 调节性 T 细胞（洋红色）的单通道图像。 (G) 邻近正常和肿瘤中 TAM1 群体（FOLR2+ 和 CD163+）、TAM2 群体（SPP1+）和 TIGIT+ 调节性 T 细胞的定量数据。 (H) 肿瘤中低 FOLR2 和高 FOLR2 区域附近 TIGIT+ 调节性 T 细胞的定量数据。 （均值 ± 标准误，n = 3，*p < 0.0001，p < 0.001，*p < 0.01，p < 0.05）。
FOLR2+ TAMs 显示免疫抑制相互作用¶
鉴于我们观察到 HCC 中的类胎儿内皮细胞和巨噬细胞以及发育中胎儿的免疫特权微环境（McGovern 等，2017），我们假设 FOLR2+ TAMs 可能参与协调免疫抑制的肿瘤微环境（TME）。这一观点进一步得到支持，即肿瘤中缺乏细胞毒性（T/NK/NKT）免疫细胞，而调节性 T 细胞（Tregs）（CD4+/TIGIT+/CTLA4+）和类胎儿 TAM1（FOLR2 高/CD163 高/CD206 高）亚群的增加。为了解析正常和肿瘤生态系统中的受体 - 配体相互作用，我们进行了细胞间相互作用分析（CellPhoneDB）（Vento-Tormo 等，2018）。我们在正常组织中观察到 314 次相互作用，在肿瘤组织中观察到 478 次相互作用（图 5C 和 S6A-S6C）。重要的是，我们在肿瘤中检测到的巨噬细胞与其他免疫细胞（CD4、CD8、NK 和 DC）之间的相互作用次数是正常微环境的两倍。这些相互作用与巨噬细胞和 TME 中其他免疫细胞之间的免疫检查点受体和配体（CD40LG:CD40，CD28;CD86，SIRPA:CD47，和 CD86:CTLA4）相关（图 5D-5F）。值得注意的是，最近的报告显示 CTLA4 介导的共刺激分子 CD80 和 CD86 从抗原呈递细胞（APCs）转内吞，从而抑制 APCs 共刺激 T 细胞的能力（Ovcinnikovs 等，2019）。此外，我们的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据显示，Tregs 和巨噬细胞是肿瘤浸润免疫细胞的主要部分（图 1B 和 1C）。因此，我们重点关注巨噬细胞与 Tregs 的相互作用，以评估个体 TAMs 在免疫调节中的作用。FOLR2+ TAM1 显示出与 Tregs 相比于 SPP1+ TAM2 亚群更多的免疫抑制相互作用（图 5G）。值得注意的是，TAM1 还表达更高水平的免疫调节趋化因子如 CXCL12 和 CXCL16 以及 CD86（图 5H）。综合这些结果表明，TAM1 可能促进 HCC 中的免疫抑制微环境。接下来，我们调查了 Tregs 和 TAM1 是否在肿瘤生态系统中的同一利基中共定位。此外，我们还调查了类胎儿 PLVAP+ 内皮细胞是否也位于 TAM1 和 Tregs 附近。令人惊讶的是，我们观察到 TAM1（CD163+）、Tregs（TIGIT+）和 PLVAP+ 内皮细胞共定位于同一利基，毗邻 ALB+ 肿瘤上皮细胞簇（图 5I）。我们还观察到在 PLVAP 密度高的区域中 CD163+ 和 TIGIT+ 细胞的富集（图 5I，S5B，S5D 和 S5E）。这些结果表明 TAM1 在肿瘤的免疫特权部位的围血管定位。与 CellPhoneDB 分析一致，我们观察到与 SPP1+ TAM2 相比，FOLR2+ TAM1 与 TIGIT+ 细胞的富集，强调了 FOLR2+ TAMs 在免疫抑制相互作用中的主要作用（图 5J 和 S5F-S5H）。我们的结果进一步展示了肿瘤生态系统中 FOLR2+ TAMs、Tregs 和肿瘤胎儿内皮细胞之间的联系。
图 S6 胎儿、正常和肿瘤组织中内皮细胞和髓系细胞的细胞间相互作用分析，相关于图 5、图 6 和图 7
(A) 邻近正常和肿瘤样本中所有细胞类型之间相互作用的点图。每一行代表一个配体 - 受体对，每一列定义一个细胞 - 细胞相互作用对。 (B) 条形图表示肝脏中邻近正常组织细胞之间配体 - 受体相互作用的频率（y 轴）。 (C) 条形图表示肝脏中肿瘤组织细胞之间配体 - 受体相互作用的频率（y 轴）。 (D) 髓系细胞中 NOTCH2 受体、下游激活子 HES1 和内皮细胞中配体 DLL4 的表达。注意 DLL4/PLVAP 在内皮细胞中的共表达以及 HES1/CD163 在 F-TAMs 中的共表达。 (E) 用于鉴定正常和 HCC 样本中单核细胞/巨噬细胞亚群的流式细胞术代表性作图策略。选择活 CD45+ 细胞，并移除谱系阳性（CD3、CD19、CD20 和 CD56）细胞（主要是 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞）。然后进一步对所得的单核细胞/巨噬细胞亚群进行 CD206 和 CD163 的共表达门控。
另见图 S6。
小鼠胚胎、人类胎肝和肿瘤巨噬细胞中的保守基因调控网络¶
我们的单细胞 RNA 测序、机器学习和整合分析结果表明，小鼠胚胎植入的人类胎肝和肿瘤巨噬细胞之间存在共享的转录程序。我们假设对这些细胞类型的基因调控网络（GRN）进行系统阐明可以帮助我们识别促进 FOLR2+ TAMs 类胎儿重编程的保守转录因子。我们采用单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）（Aibar 等，2017）来解码小鼠和人类髓系细胞的 GRN，然后进行基于调控活性的层次聚类。接下来，基于同源 GRN 的相似性，我们构建了小鼠（来自 Ms4a3Cre-RosaTdT 的 8,724 个细胞）和人类（来自胎儿、正常和肿瘤的 9,307 个细胞）髓系细胞的皮尔逊相关热图（图 6A）。我们观察到小鼠胚胎植入、人类胎肝和 HCC TAM1 巨噬细胞中的跨物种保守调控子。我们还观察到小鼠 Tomato+ 单核细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞的不同簇。有趣的是，TAM2 和 TAM3 群体形成了一个与小鼠 Tomato+ 单核细胞衍生簇接近的混合组，而与胚胎植入、胎肝和 TAM1 巨噬细胞聚类分开（图 6A）。接下来，我们试图识别每种髓系细胞类型特有的一组保守 GRN 模块。基于 SCENIC 数据，我们识别了 128 个同源 GRN，它们在小鼠和人类髓系细胞中分为 7 个主要模块。这使我们能够划定可能导致类胎儿转录程序建立的保守谱系特异性模块（图 6B）。我们在小鼠胚胎植入、胎肝和 TAM1 巨噬细胞中识别到一个保守模块（HES1、SPIC、NR1H3、MAF 等）。我们还识别了其他模块（RXRA、KLF3），它们在小鼠肝脏胚胎植入和人类胎肝巨噬细胞中是保守的，但在 HCC-TAM1 中缺失。我们特别观察到胎肝和 TAM1 巨噬细胞中模块 2 相关 TFs HES1 和 NR1H3 的激活，而在 SPP1+ TAM2 簇中相对缺失（图 6C）。共享 GRN 分析与整合分析一致，表明不同的 FOLR2+ TAM 簇（图 2F 和 3F）可能代表细胞状态（单核细胞衍生的重编程和 TRMs），而不是细胞类型，从而暗示了 HCC 中 TAMs 的类胎儿重编程。
图 6 肝脏髓系细胞的跨物种比较
(A) 来自人类（蓝色）和 Ms4a3Cre-RosaTdT 小鼠（橙色）的髓系细胞之间同源基因表达的相关性。SCENIC 分析中的 AUROC 评分用于衡量相关性评分。AUROC 评分是基于人类和 Ms4a3Cre-RosaTdT 细胞之间的皮尔逊相关计算的。 (B) 根据人类和小鼠髓系细胞中的调控活性识别转录因子模块。 (C) Louvain 聚类（如图 3F 所述）细胞类型的 t-SNE 可视化。HES1 和 NR1H3 的调控活性投影在 t-SNE 上。 (D) RNA-FISH 确定正常和肿瘤组织中 TAM1 和 PLVAP 内皮细胞的位置。F-TAMs 中的 FOLR2（绿色）和 HES1（红色）表达，内皮细胞中的 PLVAP（白色）和 DLL4（紫色）表达。注意 FOLR2/HES1 阳性 TAM1（黄色）与 PLVAP/DLL4（浅紫色）内皮细胞的毗邻位置。 (E) HCC 中 FOLR2+/HES1+ 细胞的测量（均值 ± 标准误，n = 3，**p < 0.01）。 (F) HCC 中 PLVAP+/DLL4+ 细胞的测量。注意大多数 PLVAP+ 细胞也表达 DLL4。
另见图 S6。
由于 TAM1 巨噬细胞在 TME 中与 PLVAP+ 内皮细胞共定位（图 5I），且 HES1 是经典的旁分泌 Notch 信号通路的下游效应物之一（Sharma 等，2012），我们假设 PLVAP+ 内皮细胞可能促进 TAM1 中的 Notch 信号激活，从而促进肿瘤 - 胎儿重编程。首先，我们调查了 HCC 图谱中 Notch 受体和配体的表达。我们观察到髓系细胞中的受体（NOTCH2）表达和 PLVAP+ 肿瘤 - 胎儿内皮细胞（ECs）中的配体（DLL4）表达（图 S6D）。重要的是，如图 2L 所示，HES1 在单核细胞衍生的 TAM1 亚群中特异性上调。通过 RNA-FISH 检测，我们发现 FOLR2+/HES1+ TAM1 与 PLVAP+/DLL4+ ECs 毗邻（图 6D）。与 scRNA-seq 数据一致，我们观察到一部分 FOLR2+ 细胞是 HES1+（图 6E）。我们的 RNA 速度分析预测了类胎儿 FOLR2+/HES1+ 巨噬细胞的单核细胞起源（图 2K）。另一方面，大多数 PLVAP+ ECs 也显示出 DLL4+ 表达（图 6F），表明这些肿瘤 - 胎儿 ECs 可能是激活 NOTCH2 表达的 TAM1 巨噬细胞 Notch 信号的潜在配体来源。
HCC 中的肿瘤 - 胎儿生态系统¶
包括 RNA 速度、GRN 和成像分析在内的多种研究表明，HES1 在 TAM1 的肿瘤 - 胎儿重编程中具有重要作用。接下来，我们采用体外实验来调查 PLVAP+/DLL4+ TME 是否可以将正常单核细胞/巨噬细胞群体重编程为类胎儿 TAMs。这是通过在有和没有抗 DLL4 阻断抗体的条件下，将正常 CD14+ 单核细胞与 DLL4 配体涂层珠共培养来进行的。值得注意的是，与 DLL4 配体共培养邻近正常 CD14+ 细胞导致获得 TAM1（CD163+/CD206+）表型，而添加抗 DLL4 抗体则阻止了这种重编程（图 7A、7B 和 S6E）。这些结果进一步支持了 Notch 信号激活可以促进由微环境介导的 TAMs 肿瘤 - 胎儿重编程的假设。
图 7 胎肝和 HCC 中共享的肿瘤 - 胎儿生态系统
(A) DLL4 对正常单核细胞类胎儿重编程的影响。将来自正常肝组织的 CD14+ 细胞与预先孵育有 DLL4 的 Ni-NTA 珠（有或没有抗 DLL4 抗体）或模拟物共培养，然后分析 CD163/CD206 双阳性细胞。 (B) 与对照（n = 5）或 DLL4 珠（n = 5）以及带有抗 DLL4 抗体的 DLL4 珠（n = 2）共培养的正常 CD14 细胞的定量分析。 (C) 胎肝、邻近正常和肿瘤（HCC）组织的 NanoString 数字空间分析（每种三例）。使用形态标记物 KRT、CD45、CD31 和 DAPI 选择每张切片中的 12 个感兴趣区域（ROI）。 (D) 对每个感兴趣区域（ROI）进行 96 种肿瘤 - 胎儿和免疫 - 肿瘤标记物的数字空间分析。使用主成分分析（PCA）分析过滤高变基因，然后进行层次聚类。 (E) 注意大多数胎儿和肿瘤样本在一个簇中聚集，而邻近正常样本在另一个簇中聚集。
另见图 S6 和 S7 及表 S5。
综合我们的结果表明，VEGF 介导的 PLVAP+ 内皮细胞诱导和 DLL4+ 介导的 FOLR2+ TAM1 重编程。我们还观察到 FOLR2+、PLVAP+ 和 TIGIT+ 细胞在 HCC 肿瘤微环境（TME）中的共定位，表明存在免疫抑制性利基。为了系统地理解肿瘤和胎儿生态系统之间的相似性程度，我们进行了空间转录组学分析（图 7C）。我们使用 96 个免疫、基质、上皮和肿瘤 - 胎儿标记物对三个人体胎肝、邻近正常和肿瘤组织进行分析。总共分析了来自 9 张切片的 108 个区域，然后对高度变异基因进行层次聚类。有趣的是，我们观察到大多数肿瘤和胎肝区域聚集在一起（图 7D 和 7E；表 S5），并显示出免疫抑制性（FOXP3、CTLA4、LAG3、BATF3）T 细胞和肿瘤 - 胎儿生态系统的经典特征，即 FOLR2+ 巨噬细胞、PLVAP+ 内皮细胞和 Notch/VEGF 受体配体。然而，簇 2 主要由邻近正常组织以及一些胎儿和肿瘤区域组成。此外，该簇还显示出与肿瘤 - 胎儿生态系统、免疫抑制性 T 细胞和 NOTCH/VEGF 信号相关的标记物较低的表达。
为了探讨类胎儿重编程在癌症之外的意义，我们在 Ms4a3Cre-RosaTdT 小鼠中进行了部分肝切除术，并分析了在第 0、7、14 和 28 天再生的小鼠肝脏中的约 79,000 个单细胞（图 S7A–S7E）。有趣的是，我们观察到在第 7-28 天 FOLR2+ 单核细胞衍生（Tomato+）巨噬细胞的增加（图 S7F）。此外，我们还观察到 PLVAP 表达、Notch 和 VEGF 通路成分以及与免疫抑制性 T 细胞相关的基因在肝脏再生期间的同步增加（图 S7G）。这些结果表明，在肝脏再生期间会重新出现类胎儿生态系统，这与我们在人体胎肝发育和 HCC 微环境中观察到的情况相似。
图 S7 肝切除术前后小鼠肝脏的单细胞 RNA 测序，相关于图 7
(A) 用于从小鼠（8 周）肝脏中富集 CD45+/Tomato+、CD45+/Tomato- 和 CD45- 细胞进行单细胞 RNA 测序分析的门控策略。 (B) 按簇 ID 和分选条件着色的 UMAP 图。 (C) 在 UMAP 图中髓系标志物的表达。 (D) 髓系细胞的 UMAP 子聚类，按肝切除术后天数和分选条件着色。 (E) 在 UMAP 图中 Lyz2、Folr2、c1qb 和 Mrc1 (Cd206) 的表达。 (F) 肝脏恢复期间单核细胞衍生的 Tomato+（重编程）和胚胎植入的 Tomato+（组织驻留）FOLR2+ 巨噬细胞的定量分析。 (G) 肝脏恢复期间与 Notch/VEGF 信号、PLVAP+ 内皮细胞和免疫抑制性 T 细胞相关基因的表达。 (H) 比较 HCC 训练与肝硬化肝脏（Ramachandran 等，2019）数据的相关性热图。 (I) 比较 HCC 内皮细胞训练与 Ramachandran 等（2019）数据中的内皮细胞的相关性热图。注意肿瘤 PLVAP+ 内皮细胞与肝硬化肝脏特异性簇 6（PLVAP 内皮细胞）之间的高相关性。 (J) 比较 HCC 髓系细胞训练与肝硬化肝脏巨噬细胞（Ramachandran 等，2019）数据的相关性热图。注意 TAM1 与 KC 以及 SMac2（瘢痕相关巨噬细胞）群体之间的高相关性。
另见图 S6 和图 S7 及表 S5。
讨论¶
肿瘤发生是一个多步骤的过程，在创始细胞的致癌转化的初始瓶颈之后，其最终的生存依赖于其能够在有利的环境中定殖（Burrell 等，2013；McGranahan 和 Swanton，2017）。一个有利的肿瘤生态系统不仅促进癌细胞的生长，还为其提供了一个安全的利基来克服免疫系统的攻击。最近，有报道称，儿科肾细胞癌在成年稳态期间表现出异常胎儿细胞的特征，伴随着异常的 WT1（Wilms 肿瘤 1）表达（Young 等，2018），再次强调了发育异常和肿瘤之间的联系。然而，肿瘤和胎儿微环境之间的比较分析，以探讨肿瘤生态系统是否重现了类胎儿特性，仍然有待研究。在此，我们生成了一份全面的人类肝脏单细胞图谱，以了解从胎儿发育到癌症的细胞景观。我们调查了在早期发育到晚期疾病过程中约 212,000 个人类和小鼠肝细胞。我们确定了胎肝和肿瘤微环境之间共享的细胞类型、转录程序、GRN 和信号通路，表明 HCC 中生态系统的肿瘤 - 胎儿重编程。这些结果提供了对胎肝和 HCC 生态系统之间共享程序的前所未有的见解。
为了了解人类肝脏的细胞景观及其在癌症中的意义，我们首先关注了肿瘤组织中特别丰富的细胞类型。这导致我们鉴定了 PLVAP+ 内皮细胞，这些细胞在 HCC 中主要存在，而在邻近正常组织中则较少。有趣的是，已知 PLVAP 调节内皮细胞的通透性和抗原进入淋巴结的过程（Rantakari 等，2015）。重要的是，PLVAP 在小鼠胎肝发育过程中在 TRMs 的播种中起关键作用（Rantakari 等，2016）。鉴于在小鼠胎肝中报道的 PLVAP+ 内皮细胞，我们首先调查 PLVAP+ 内皮细胞是否也存在于人类胎肝中。事实上，我们在人体胎肝组织中检测到了 PLVAP+ 细胞。值得注意的是，肿瘤邻近的正常肝组织缺乏 PLVAP+ 内皮细胞，这表明 HCC 中内皮细胞的类胎儿重编程。当这项工作在审查时，PLVAP+ 内皮细胞也在肝硬化但未在健康肝脏中报道（Ramachandran 等，2019）。我们使用机器学习方法 Garnett 比较 HCC 图谱与肝硬化肝脏，并观察到 HCC 和肝硬化肝脏 PLVAP+ 细胞之间的强转录相似性（图 S7H-S7J）。我们的 NicheNet 分析也表明肝细胞驱动的 VEGFA 在诱导内皮细胞中 PLVAP 表达中的作用。鉴于肝细胞介导的 VEGFA 在胎肝器官发生和再生中的重要性，推测胎肝类 PLVAP+ 内皮细胞的再现可能在癌症发生之外具有更广泛的作用，需要进一步研究。
接下来，我们调查了这些类胎儿内皮细胞在肿瘤生态系统中的意义。鉴于 PLVAP+ 内皮细胞在小鼠胎肝发育过程中吸引 TRMs 的作用，我们调查 TAMs 是否也表现出 FLM 特征。我们在 HCC 中鉴定了三种 TAM 亚群（FOLR2+、SPP1+ 和 MT1G+），其中 FOLR2+ TAMs 与人类 FLMs 具有显著的转录特征相似性。此外，RNA 速度分析揭示了 FOLR2+ TAM1s 的二分性，其中一部分似乎是组织驻留，而另一部分可能是单核细胞衍生的。我们还比较了 FOLR2+ TAM1 与 Ms4a3Cre-RosaTdT 小鼠胚胎植入和人类胎肝巨噬细胞的转录谱，并观察到这些细胞类型之间的强相关性。这些结果不仅确立了 FOLR2+ TAM1 的胚胎特性，还支持 HCC 中 TME 的肿瘤 - 胎儿重编程。通过比较分析，我们观察到了跨物种的转录因子显著保守性，特别是在小鼠胚胎植入、胎肝和 TAM1 巨噬细胞中观察到了 HES1 和 NR1H3 转录因子的保守性。最近，关于小鼠肝脏利基的两项不同研究（Bonnardel 等，2019；Sakai 等，2019）展示了 DLL4-NOTCH 介导的单核细胞向 Kupffer 细胞样表型重编程的意义，表明了 Notch 信号在肝脏 TRMs 中的重要性。由于肝脏是叶酸储存和代谢的主要器官，胎儿和肿瘤巨噬细胞中 FOLR2 的高表达需要进一步研究 TAM1 在肿瘤发生过程中叶酸代谢中的作用。除了 TAM1，我们还在 HCC 中鉴定了 SPP1 表达的 TAM2 亚群。有趣的是，SPP1+ 巨噬细胞最近与含脂质组织相关联，被称为脂质相关巨噬细胞（LAMs）（Jaitin 等，2019）。与最近识别的依赖于利基的表型和 TRMs 的功能编程一致（Chakarov 等，2019），我们的结果为肝脏肿瘤中的巨噬细胞异质性和功能提供了新的见解。
发育中的胎儿表现出耐受性免疫反应，主要由免疫抑制性调节性 T 细胞维持，这种反应在出生后逐渐下降（McGovern 等，2017）。类似地，肿瘤也培养出抑制性的免疫系统，表现为调节性 T 细胞和耗竭的 CD8+ T 细胞的富集。事实上，在我们的单细胞 RNA 测序分析中，我们也检测到 HCC 中特定的调节性 T 细胞的富集和细胞毒性免疫（CD8，NKT 和 NK）细胞的排除。发现肿瘤 - 胎儿 PLVAP+ 内皮细胞和 FOLR2+ TAM1 进一步激发了我们解析这些细胞在 TME 调节中的作用。细胞间相互作用分析显示，在 HCC 中巨噬细胞和 T 细胞群体之间免疫抑制相互作用显著增加。有趣的是，在三种 TAM 亚群中，FOLR2+ TAM1 与 Tregs 的免疫抑制相互作用比 SPP1+ TAM2 更为显著。我们进一步显示 PLVAP+ 内皮细胞和 FOLR2+ TAM1 在肿瘤中与 Tregs 共定位，表明肿瘤 - 胎儿重编程在动员免疫抑制 TME 中的作用。通过在空间转录组学分析中使用更大范围的免疫 - 肿瘤标记物，我们验证了这些观察结果。我们展示了胎肝和 HCC 之间共享的免疫和基质微环境。我们还观察到在富含 FOLR2+ 巨噬细胞、PLVAP+ 内皮细胞和免疫抑制性 T 细胞的微环境中 NOTCH 和 VEGF 信号成分的高表达，表明 VEGF 和 NOTCH 信号在维持肿瘤 - 胎儿生态系统中的重要性。鉴于免疫抑制性肿瘤 - 胎儿 TME 以及免疫检查点抑制剂在晚期 HCC 治疗中的作用（Okusaka 和 Ikeda，2018），研究我们的空间转录组学面板是否可以指导检查点抑制剂的治疗分层将是非常有趣的。
综上所述，我们的研究报告了人类胎肝和 HCC 之间共享的细胞类型、转录程序和信号成分。这些结果表明 VEGF/NOTCH 信号在维持 HCC 中的免疫抑制肿瘤 - 胎儿生态系统中的作用。这些发现尤其有趣，因为最近的 IMBrave150 HCC 临床试验（Cheng 等，2019）报告，与索拉非尼单药治疗相比，VEGF 和检查点抑制剂的组合疗法具有更好的疗效。因此，我们得出结论，VEGF/NOTCH 介导的免疫抑制肿瘤 - 胎儿生态系统的概念不仅为治疗干预提供了新的靶点，还可以作为 HCC 患者免疫治疗分层的潜在生物标志物。我们在 HCC 中发现的肿瘤 - 胎儿重编程也为在其他癌症中识别和理解类似范式开辟了途径。