Single cell analysis reveals new evolutionary complexity in uveal melanoma（参考 2）

摘要

虹膜黑色素瘤（UM）是一种高度转移性的癌症，与表皮黑色素瘤相比，UM 在很大程度上不响应检查点免疫治疗。在这里，我们利用来自 8 个原发灶和 3 个转移灶的 59,915 个肿瘤和非肿瘤细胞的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），以单细胞分辨率审查肿瘤微环境。肿瘤细胞显示了新的亚克隆基因组复杂性和转录状态。肿瘤浸润免疫细胞包括以 LAG3 为主要检查点标记物的 CD8+T 细胞，而不是 PD1 或 CTLA4。V(D)J 分析显示克隆扩增的 T 细胞，表明它们能够发起免疫应答。来自 1B 类 UM 的慢性肝转移灶中浸润有克隆扩增的浆细胞，表明存在抗体介导的免疫。肿瘤和免疫细胞的这种复杂生态系统为 UM 生物学提供了新的见解，并确定 LAG3 作为高危 UM 患者中免疫检查点阻断的潜在候选物。

介绍

虹膜黑色素瘤（UM）是一种高度转移性的癌症，与表皮黑色素瘤相比，它在很大程度上不响应检查点免疫治疗。在这里，我们利用来自八个原发灶和三个转移灶的 59,915 个肿瘤和非肿瘤细胞的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），以单细胞分辨率审查肿瘤微环境（TME）。对肿瘤细胞的分析确认了通过批量分析建立的全局基因组景观，并揭示了新描述的亚克隆基因组复杂性和与表型可塑性一致的转录状态。

UM 以其其良好描述的基因组景观、高转移死亡率和对治疗的抵抗能力而闻名，包括免疫检查点抑制剂。根据基因表达谱（GEP）、进展性突变和染色体拷贝数变异（CNV）等标志性特征，已经确定了预后不同的分子亚型。UMs 的 1 类 GEP 通常携带 EIF1AX 的突变（1A 类，低转移风险）、SF3B1 或其他剪切因子（1B 类，中等转移风险），并表现出 6p 和 8q 的染色体增益。而具有 2 类 GEP（高转移风险）的 UM 则与 BAP1 失活突变、染色体 1p、3、6q 和 8p 的缺失以及 8q 的增益相关。基于对批量测序数据的计算推断，UM 似乎经历了一个早期的突发式进化爆发，其中一个完整的典型异常集合产生了特定的亚型，之后进一步的异常积累为中性的乘客事件。

单细胞 CNV 分析

接下来，我们使用 CNV 作为探究每个肿瘤的克隆结构的手段。通过使用 inferCNV 从单细胞 RNA 测序数据中确定了每个细胞的 CNV 内容，该结果与单细胞 DNA 测序进行了正交验证（补充图 4a）。我们进行了隐藏马尔可夫和贝叶斯潜在混合建模，以确定亚克隆 CNV 事件并移除置信度较低的 CNV 调用。该分析揭示了以前未被认识到的经典和非经典 CNV 的复杂性（图 2a–c 和补充图 4b）。虽然经典 CNV 在染色体景观中占主导地位，但样本中存在着多个亚克隆的经典和非经典 CNV。令人惊讶的是，class 1 肿瘤中含有经典 class 2 CNV 的亚克隆（例如 1p、3 和 8p 的丢失），而 class 2 肿瘤则含有经典 class 1 CNV 的亚克隆（例如 6p 和 6q 的增益）。此外，我们发现经典 CNV 并不总是发生在单个事件中，而是可以由持续的基因组进化产生。例如，五个案例（BSSR0022、UMM062、UMM063、UMM065 和 UMM067L）显示了首先获得 8q 的证据，随后获得 8p。在 UMM065 中，23% 的亚克隆中的 3q 的丢失后来被 6% 的亚克隆中的 3p 的丢失所跟随，导致 LOH3。尽管存在 LOH3 细胞，但该肿瘤的 GEP 是 class 1，这很可能是因为 LOH3 在一个小的亚克隆中，并且 BAP1 突变尚未发生，这与 class 2 GEP 需要 LOH3 和在染色体 3 的另一份拷贝上的 BAP1 突变的概念一致（参考文献 12）。以前的研究表明，经典基因组异常在 UM 中早期出现，并导致与特征性驱动突变相关的三种主要进化轨迹之一 - EIF1AX 在 class 1 A 中，SF3B1 和其他剪接突变在 class 1B 中，以及 BAP1 在 class 2 肿瘤中出现 9,10，然而，我们当前的研究结果以单个细胞分辨率显示，这些肿瘤继续随着迄今未被识别的非经典 CNV 亚克隆的发展而演变，这可能会促进肿瘤的进展，正如最近的研究所建议的那样 13。

a 代表性的 CNV 热图，通过 inferCNV 分析从每个 GEP 类别中进行了分层聚类。 b 从每个 11 个患者的单细胞 RNA 测序数据推断出的 CNV 概要图。CNV 根据 inferCNV 计算的发生在染色体臂的事件进行了注释。UM 中的经典 CNV 事件显示在顶部作为注释（红色，class 2；蓝色，class 1；绿色，class 1 和 2）。源数据以源数据文件的形式提供。 c 每个 11 个患者的克隆性树，按 GEP 类别分开。分支根据包含相应 CNV 的计算亚克隆中的细胞百分比进行了缩放。* 表示通过批量 DNA 测序发现的突变发生在亚克隆中，因此无法分配到树的特定分支。

转录轨迹分析

在皮肤黑色素瘤中，越来越多的证据表明肿瘤细胞在转录状态之间发生可逆转换，并且这种可塑性驱动了转移和治疗抵抗。为了阐明 UM 细胞的转录状态，我们首先使用 SCENIC 对 scRNA-seq 数据进行了分析，以识别潜在的共表达模块及其相关的顺式调控元件。最常见的基序包括癌基因 MYC 和 JUN，以及 bHLH-PAS 缺氧相关转录因子 ARNT，所有这些基序都在 class 2 肿瘤的细胞中富集。接着，我们使用 Monocle 2 对 scRNA-seq 数据进行了分析，该软件重建了假定的分支转录轨迹，以识别计算状态之间的潜在关系。所有肿瘤细胞的伪时间排序产生了总共 16 个状态，分为两个主要分支，根据 GEP 类别 1 和类别 2 自行分类。在个别样本的水平上，来自类别 1 肿瘤的细胞富集在状态 1-4、14-16 中，而来自类别 2 肿瘤的细胞富集在状态 5-13 中，确认类别 1/类别 2 分区是 UM 全局分子景观的基本特征。然后，我们使用 Monocle 2 对每个样本的轨迹进行了单独分析，使用分支表达分析建模（BEAM）和层次聚类来识别跨状态富集的基因。在个别样本中，这些状态分布在亚克隆和细胞周期阶段中，表明在体内表型可塑性可能类似于在黑色素瘤细胞系中描述的情况。

a 使用 SCENIC 分析确定的富集转录因子基序，显示为 z-score 归一化的富集值热图，涉及 8598 个肿瘤细胞。b 使用 Monocle 2 对通过 5′基因表达化学方法获得的 7947 个葡萄膜黑色素瘤细胞进行的轨迹分析，注释为计算状态。c 根据样本注释的轨迹分析，并以 GEP 类别的颜色叠加显示。d 通过每个样本显示的联合 Monocle 2 轨迹分析，并根据计算状态进行注释。e 图表描述了通过 BEAM 分析确定的每个样本聚类，然后通过层次聚类分析发现的重要通路。

免疫细胞和 V(D)J 免疫库分析

肿瘤细胞在转录状态之间的适应性可塑性是由 TME 的信号驱动的 4,14，我们通过生成免疫细胞的 t-SNE 图进行了调查（图 4a 和附图 7a），并对跨肿瘤样本的每个聚类的平均基因表达进行了分层聚类（图 4b 和附图 7b–d）。T 细胞存在于所有样本中，包括 CD8+ 细胞毒性 T 细胞（平均 0.2% 的 1 类对比于 17% 的 2 类和转移）和 CD8+T 效应记忆细胞（平均 2% 的 1 类对比于 12% 的 2 类和转移）（图 4c 和附图 8a）。大多数 T 细胞是 CD8+，CD4+ 细胞的人群较小，包括滤泡辅助细胞、FOXP3+ 调节细胞和原始淋巴细胞。通过 scRNA-seq 数据的 V(D)J 重组分析显示，仅有三个样本中存在克隆扩增的 T 细胞（图 4d），全部为 2 类原发性肿瘤，但它们与疲惫的 T 细胞克隆扩展。CD8+T 细胞表达的疲惫相关免疫检查点分子 LAG3 最强，TIGIT 变化，PDCD1（PD1）、CTLA4、HAVCR2（TIM3）和 TNFRSF9 的表达最小（图 4e 和附图 7c、d）。使用多色免疫组化在 18 个样本中对 LAG3、CTLA4 和 PD1 的蛋白表达进行了正交验证（图 4f、g 和附图 8b）。这些发现，再加上肿瘤细胞中 PD-L1 和 PD-L2 的低表达（附图 9a、b），部分解释了转移性 UM 中 CTLA4 和 PD1 阻断的无效性 1，并提示 LAG3 在 UM 中 T 细胞疲惫中的潜在作用。与其他癌症类型的发现类似 18，LAG3 在一些 CD4+T 细胞、FOXP3+ 调节性 T 细胞、NK 细胞和巨噬细胞/单核细胞中也有表达（附图 10）。CD14+ 单核细胞/巨噬细胞存在于所有原发性和转移性样本中，CD68+ 巨噬细胞显示从 M1 到 M2 极化的光谱（图 4b、c 和附图 7b）。NK 细胞在大多数样本中存在，它们在肿瘤样本中分布均匀。B 细胞和浆细胞在大多数样本中很少见。然而，值得注意的是，一个引人注目的样本（BSSR0022）来自于一个单一的生长缓慢的肝转移灶，29 年前治疗过一类 1B 原发性肿瘤，其中包含有克隆扩增的浆细胞，这表明异常持续和缓慢的临床行为是由抗体介导的免疫所促成的。

a TME 中存在的 9441 个单个免疫细胞的 t-SNE 图。b 免疫细胞聚类的平均 RNA 表达热图。c 免疫细胞亚型的三维柱状图，显示每个肿瘤的免疫细胞种群的百分比。d 从 10 个原发性和转移性 UM 以及一个温和的 1B 类转移灶中的 B 细胞中对 T 细胞进行的单细胞 V(D)J 重组库测序。红色，克隆型频率≥4% 的 T 细胞；紫色，克隆型频率<4% 和≥2.5% 的 T 细胞；蓝色，克隆型频率<2.5% 和≥1.5% 的 T 细胞；灰色，所有其余克隆型频率<1.5% 的 T 细胞。源数据见源数据文件。e CD8+T 细胞亚群的脊形图，显示 LAG3 的强表达，TIGIT 的中等表达，以及 PD1、CTLA4、TIM3 和 TNFRSF9 的最小表达。f CD8、LAG3、PD1、CTLA4 和 DAPI 的多色免疫组化定量。共分析了 18 个样本，其中包括 7 个通过 scRNA-seq 分析的样本和额外的 11 个样本。转移样本包括 BSSR0022 和 UMM067L。其他样本代表原发性肿瘤。每个样本的定量是通过对单个玻片进行整体扫描完成的。源数据见源数据文件。g 一个原发性和一个转移性 2 类 UM 的典型多色免疫组化图像，染色为 CD8、LAG3、PD1、CTLA4 和 DAPI（比例尺，50μm）。